Séquençage des récepteurs T par protocole RNA-Seq

Isolation et évaluation de la qualité de l'ARN

1. Assurez-vous d'une configuration correcte de la station de amorçage des puces.
2. Les composants du kit suivants doivent être préparés avant la première utilisation conformément aux instructions du fabricant :
(a) Aliquotes de ladder d'ARN, stables à -70 °C pendant de longues périodes.
(b) Les aliquotes de matrice de gel Agilent RNA 6000 Nano (65 μl) peuvent être conservées à 4 °C pendant 1 mois (protéger de la lumière pendant l'utilisation).
3. Pour préparer la matrice de gel-teinture, laissez un aliquote de matrice de gel Agilent RNA 6000 Nano (65 μl) et le concentré de teinture RNA 6000 Nano atteindre la température ambiante pendant 30 minutes.
4. Vortexez les concentrés de teinture pendant 10 s et centrifugez.
Pipette 1 μl de concentré de colorant dans 65 μl de matrice de gel (un aliquote) dans un tube de microcentrifugeuse.
6. Vortexez soigneusement et vérifiez le bon mélange du gel et du colorant.
7. Centrifuge à température ambiante pendant 10 minutes à 13 000 ×g, à l'abri de la lumière, et utilisez dans les 1 jour. Conservez à 4 °C si non utilisé immédiatement.
8. Pour charger la matrice gel-teinture, vérifiez le bon réglage de la station de amorçage de la puce et placez une puce RNA 6000 Nano inutilisée sur la station de amorçage de la puce.
Pipettez 9,0 μl du mélange gel-teinture au fond du puits "G" avec un fond noir.
10. Positionnez le piston de la seringue dans la station de amorçage de la puce à 1 ml ; puis fermez la station de amorçage de la puce et pressurisez rapidement en enfonçant le piston. Maintenez pendant exactement 30 s.
11. Relâchez le piston et tirez doucement jusqu'au repère de 1 ml.
12. Ouvrez la station de amorçage de la puce et pipettez 9,0 μl de matrice gel-colorant au fond des deux puits marqués "G" sans fond.
13. Pour charger l'échelle et l'échantillon dans la puce, pipettez 5 μl de marqueur d'ARN dans tous les puits d'échantillon et dans le puits marqué du symbole de l'échelle.
14. Ajoutez 1 μl de l'échelle dans le puits marqué du symbole de l'échelle.
15. Ajoutez 1 μl d'ARN d'intérêt dans tous les puits d'échantillons. S'il y a moins de 12 échantillons à mesurer, mettez 1 μl de marqueur d'ARN dans les puits qui ne sont pas utilisés.
16. Vortexez la puce horizontalement dans le vortex IKA (1 min, 2400 tr/min), puis insérez-la dans la station Bioanalyzer 2100 dans les 5 minutes pour effectuer l'analyse à l'aide du logiciel 2100 Expert.

Préparation de la bibliothèque

Purification et fragmentation de l'ARNm

1. Apportez 0,1 à 1,0 μg d'ARN total à un volume de 50 μl en utilisant de l'eau ultrapure sans nucléase et transférez dans les puits individuels de la plaque à billes d'ARN.
2. Billes de purification d'ARN Vortex et transférer 50 μl dans chaque puits.
3. Scellez la plaque avec Microseal "B" et secouez la plaque (1 min, 1000 tr/min).
4. Chauffez la plaque dans le système de microchauffage (5 min, 65 °C, couvercle fermé), puis refroidissez sur de la glace (1 min).
5. Incubez la plaque à température ambiante (5 min). Pendant ce temps, amenez le système de microchauffage à 80 °C.
6. Pour l'attraction magnétique, retirez le sceau et placez la plaque sur le support magnétique. Inspectez visuellement jusqu'à ce que le liquide soit clair.
7. Retirez le surnageant de tous les puits. Ensuite, retirez la plaque du support.
8. Pipettez 200 μl de tampon de lavage des billes dans tous les puits ; scellez la plaque et mélangez en secouant (1 min, 1000 rpm).
9. Répétez les étapes 6 et 7.
10. Pipettez 50 μl de tampon d'élution dans tous les puits ; scellez la plaque et mélangez en secouant (1 min, 1000 rpm).
11. Chauffez la plaque dans le système de microchauffage (2 min, 80 °C, couvercle fermé), puis refroidissez sur de la glace (1 min).
12. Placez la plaque sur le banc et retirez le sceau.
13. Pour préparer la fragmentation de l'ARN, pipettez 50 μl de tampon de liaison aux billes dans tous les puits ; scellez la plaque et mélangez en secouant (1 min, 1000 tr/min).
14. Incubez la plaque à température ambiante (5 min).
15. Répétez les étapes 6 à 9 (extraction magnétique, lavage des billes, nouvelle extraction magnétique).
16. Pipette 19,5 μl de Fragment, Prime, Finish Mix dans tous les puits, scellez la plaque et mélangez en secouant (1 min, 1000 tr/min).
17. Retirez le sceau et transférez les échantillons puits par puits sur la plaque de fragmentation de l'ARN.
18. Scellez la plaque et exécutez le programme suivant sur le thermocycleur avec le couvercle préchauffé :
(a) 94 °C pendant 8 min
(b) Conserver à 4 °C.
19. Faites rapidement descendre.

Synthèse de cDNA de première chaîne

Des fragments d'ARN purifiés sont transcrits à l'envers en ADNc de première chaîne à l'aide de primers hexamères aléatoires.
1. Pour l'aspiration magnétique, placez la plaque sur le support magnétique. Inspectez visuellement jusqu'à ce que le liquide soit clair.
2. Retirez le sceau et transférez 17 μl de surnageant puits par puits sur la plaque de cDNA.
3. Centrifugez le mélange Act D de la première synthèse de brin (5 s, 600 ×g).
4. Mélangez la transcriptase inverse SuperScript II et le mélange Act D de synthèse du premier brin dans un rapport de 1:10 (1 μl de transcriptase inverse SuperScript II plus 9 μl de mélange Act D de synthèse du premier brin (peut être conservé pendant de longues périodes à -20 °C).
Pipettez 8 μl de ce mélange dans chaque puits de la plaque de cDNA et mélangez en secouant (20 s, 1600 rpm).
6. Centrifuger à 280 ×g pendant 1 minute.
7. Exécutez le programme suivant sur le thermocycleur avec le couvercle préchauffé à 100 °C :
(a) 25 °C pendant 10 min.
(b) 42 °C pendant 15 min.
(c) 70 °C pendant 15 min.
(d) Conserver à 4 °C.

Synthèse de cDNA de deuxième brin

Ajoutez 5 μl de tampon de resuspension dans chaque puits.
2. Centrifuge le mélange de marquage de la deuxième chaîne (5 s, 600 ×g), puis pipettez 20 μl dans chaque puits et mélangez en secouant (20 s, 1600 rpm).
3. Centrifugez la plaque (1 min, 280 ×g).
4. Placez la plaque sur le thermocycleur avec le couvercle préchauffé à 30 °C et faites fonctionner à 16 °C pendant 60 minutes. Laissez ensuite revenir à température ambiante.
5. Pipette 90 μl de billes AMPure XP dans une nouvelle plaque de purification de cDNA, et transférez le contenu de la plaque de cDNA puits par puits dans la plaque de purification de cDNA. Mélangez en agitant (2 min, 1800 rpm).
6. Incuber à température ambiante (15 min), puis centrifuger (1 min, 280 ×g).
7. Placez la plaque sur le support magnétique. Inspectez visuellement jusqu'à ce que le liquide soit clair. Retirez 135 μl de surnageant de chaque puits.
8. Lavez les billes avec la plaque maintenue sur le support magnétique en ajoutant 200 μl d'éthanol à 80 % dans tous les puits. Après 30 secondes, retirez tout le surnageant de chaque puits.
9. Répétez l'étape 8 et retirez soigneusement tout l'éthanol restant (en utilisant une pipette de petit volume). Laissez les échantillons sécher à l'air sur le support magnétique (15 min).
10. Retirez la plaque du support et pipettez 17,5 μl de tampon de resuspension dans tous les puits. Mélangez en agitant (2 min, 1800 tr/min). Laissez reposer à température ambiante (2 min).
11. Centrifuger à basse vitesse (1 min, 280 ×g).
12. Placez la plaque sur le support magnétique. Inspectez visuellement jusqu'à ce que le liquide soit clair. Transférez 15 μl de surnageant dans la nouvelle plaque (plaque d'adaptation pour ligation). C'est le premier point d'arrêt sûr, où la plaque scellée peut être conservée à -20 °C pendant 1 semaine.

Adenylation à l'extrémité 3' et ligature d'adaptateurs

Ajoutez 2,5 μl de tampon de resuspension dans tous les puits de la plaque de ligation de l'adaptateur et centrifugez (5 s, 600 ×g).
2. Pipette 12,5 μl de mélange A-Tailing dans chaque puits et mélangez en secouant (2 min, 1800 rpm).
3. Couvrez la plaque avec Microseal "B" et centrifugez (1 min, 280 ×g).
4. Incuber à 37 °C dans un système de microchauffage (30 min), puis transférer dans un système de microchauffage à 70 °C (5 min, couvercle fermé), et refroidir sur glace (1 min).
5. Centrifuger le plateau d'index TruSeq RNA CD (1 min, 280 ×g).
6. Transférez tous les puits des plaques de ligation de l'adaptateur dans cet ordre :
(a) 2,5 μl de tampon de resuspension
(b) 2,5 μl de mélange de ligation
(c) 2,5 μl d'adaptateurs d'ARN de la plaque d'adaptateurs d'index (dans chaque puits correspondant). Et mélanger en secouant (2 min, 1800 tr/min).
7. Centrifugez la plaque (1 min, 280 ×g) et transférez-la dans le système de microchauffage (10 min, 30 °C, couvercle fermé), puis refroidissez sur glace.
8. Centrifuge le tampon de ligation Stop (5 s, 600 ×g) et ajoutez 5 μl à chaque puits. Mélangez en secouant (2 min, 1800 rpm).
9. Centrifugez la plaque (1 min, 280 ×g).
Ajoutez 42 μl de billes AMPure XP dans chaque puits. Mélangez en secouant (2 min, 1800 rpm).
11. Incubez à température ambiante (15 min), puis centrifugez la plaque (1 min, 280 ×g).
12. Placez la plaque sur le support magnétique. Inspectez visuellement jusqu'à ce que le liquide soit clair (environ 5 minutes). Retirez tout le surnageant.
13. Lavez les billes avec la plaque maintenue sur le support magnétique en ajoutant 200 μl d'éthanol à 80 % dans tous les puits. Après 30 secondes, retirez l'éthanol.
14. Répétez l'étape 13 et retirez soigneusement tout l'éthanol restant (en utilisant une pipette à faible volume). Laissez les échantillons sécher à l'air sur le support magnétique (15 min).
15. Retirez le support de plaque et pipettez 52,5 μl de tampon de resuspension dans chaque puits, puis mélangez en secouant (2 min, 1800 tr/min).
16. Incuber à température ambiante (2 min).
17. Centrifugez la plaque (1 min, 280 ×g) et placez-la sur le support magnétique. Inspectez visuellement jusqu'à ce que le liquide soit clair.
18. Transférez 50 μl de surnageant puits par puits dans une nouvelle plaque.
19. Répétez les étapes 10 à 17, mais utilisez 50 μl de billes AMPure XP à l'étape 10 et 22,5 μl de tampon de resuspension à l'étape 15.
Transférez 20 μl de surnageant puits par puits dans une nouvelle plaque. La plaque scellée peut être conservée à -20 °C pendant 1 semaine (c'est le deuxième point d'arrêt sûr).

Enrichissement de fragments d'ADN

1. Sur de la glace, pipettez 5 μl de cocktail de primers PCR et 25 μl de mélange maître PCR dans chaque puits, mélangez en secouant (20 s, 1600 rpm), puis centrifugez (1 min, 280 ×g).
2. Transférer dans le thermocycleur avec le couvercle préchauffé réglé à 100 °C et lancer l'exécution.
3. Centrifuge la plaque (1 min, 280 ×g) et pipettez 47,5 μl de billes AMPure XP dans chaque puits. Mélangez en agitant (2 min, 1800 rpm).
4. Incuber à température ambiante (15 min), puis centrifuger (1 min, 280 ×g).
5. Placez la plaque sur le support magnétique. Inspectez visuellement jusqu'à ce que le liquide soit clair. Retirez tout le surnageant.
6. Lavez les billes avec la plaque maintenue sur le support magnétique en ajoutant 200 μl d'éthanol à 80 % dans tous les puits. Après 30 secondes, retirez l'éthanol.
7. Répétez l'étape 6 de la sous-section 3.2.5 et retirez soigneusement tout l'éthanol restant (en utilisant une pipette à faible volume). Laissez les échantillons sécher à l'air sur un support magnétique (15 min).
8. Resuspendre les billes dans 32,5 μl de tampon de resuspension. Mélanger en agitant (2 min, 1800 rpm).
9. Incuber à température ambiante (2 min), puis centrifuger (1 min, 280 ×g).
10. Place la plaque sur un support magnétique. Inspectez visuellement jusqu'à ce que le liquide soit clair, puis transférez 30 μl de surnageant dans une nouvelle plaque. Les bibliothèques peuvent être conservées à -20 °C pendant 1 semaine (c'est le troisième point d'arrêt sûr).

Séquençage

Le séquençage des bibliothèques est effectué sur un système de séquençage Illumina. Plusieurs configurations existent qui fournissent un rendement ciblé de 30 millions de lectures par échantillon (par exemple, les systèmes Illumina NextSeq 550, 1000 et 2000 ainsi que le NovaSeq 6000). En fonction du système de séquençage sélectionné, de la cellule de flux et de la longueur de lecture, entre 4 et 132 échantillons (maximum : deux cellules de flux S4 sur le NovaSeq 6000 avec un séquençage de 2x100 pb) peuvent être multiplexés dans une seule course de séquençage.