Protocole de séquençage d'amplicons ciblés par PCR multiplex pour le génotypage SNP

PCR multiplexe

1. Préparez le mélange de amorces en ajoutant toutes les amorces directes et inverses. Dans la solution résultante, chaque amorce doit avoir une concentration finale de 1 μM.
2. Préparez le mélange maître multiplex en ajoutant tous les réactifs sauf le modèle d'ADN. Préparez suffisamment de mélange maître pour tous les échantillons et les témoins PCR.
3. Distribuez 16 μl du mélange maître dans des bandes/plaques PCR et fermez tous les couvercles.
4. Pour éviter la contamination croisée, ajoutez 4 μl de l'ADN modèle dans chaque tube de réaction individuellement (ouvrez uniquement un tube ou une rangée de tubes à la fois).
5. Après la préparation de la PCR, placez les tubes/strips/plaques dans un thermocycleur en dehors du laboratoire d'ADN ancien, et lancez l'amplification : étape initiale à 95 °C pendant 10 min pour activer la polymérase à démarrage à chaud, suivie de 30 cycles de dénaturation pendant 10 s à 94 °C, d'hybridation des amorces pendant 30 s à la température d'hybridation requise, et d'élongation pendant 30 s à 72 °C. Le protocole se termine par une étape d'extension finale à 72 °C pendant 4 min.
6. Après l'amplification, diluez les réactions de 1:10 à 1:100 avec de l'eau de qualité HPLC. Cela sera le modèle pour le PCR d'indexation.

Indexation PCR

1. Préparez le mélange maître en ajoutant tous les réactifs sauf les produits de PCR multiplex dilués et les amorces d'indexation barcodées. Préparez un mélange maître suffisant pour tous les échantillons et les témoins PCR.
2. Distribuez 7 μl du mélange maître dans des bandes/plaques PCR et fermez tous les couvercles.
Ajoutez 2 μl de l'amorce de code-barres individuelle à chaque tube de réaction.
4. Ajoutez 1 μl de produit PCR dilué (de l'étape 1) à chaque tube de réaction individuellement.
5. Après la préparation de la PCR, effectuez la PCR d'indexation dans un thermocycleur : étape initiale à 95 °C pendant 10 min pour activer la polymérase à démarrage à chaud, suivie de 10 cycles de dénaturation pendant 15 s à 95 °C, d'hybridation des amorces pendant 30 s à 60 °C, et d'élongation pendant 60 s à 72 °C. Le protocole se termine par une étape d'extension finale à 72 °C pendant 4 min.

Purification et quantification de la bibliothèque

1. Préparez le mélange maître en ajoutant tous les réactifs sauf les produits de PCR multiplex dilués et les amorces d'indexation codées. Préparez suffisamment de mélange maître pour tous les échantillons et les témoins PCR.
2. Purifiez les réactions sur une plaque magnétique à 96 puits en utilisant les billes de réactif Agencourt AMPure XP conformément aux instructions du fabricant. Éluiez et conservez l'ADN dans 20 μl d'eau de qualité HPLC.
3. Quantifiez les bibliothèques d'amplicons purifiés avec l'essai de quantification dsDNA Quant-iT™ PicoGreen® selon les instructions du fabricant.
4. Regroupez toutes les bibliothèques d'échantillons en utilisant une quantité égale d'ADN.

Séquençage

1. Mesurez la concentration d'ADN de la bibliothèque en pool sur un fluoromètre Qubit selon les instructions du fabricant, et diluez à la concentration requise.
2. Séquencer des bibliothèques d'amplicons purifiées et regroupées sur des séquenceurs Illumina en utilisant CS1, CS2 et leurs compléments inverses comme amorces de séquençage selon les instructions du fabricant.

Référence :

1. Wutke S, Ludwig A. Amplification PCR ciblée et séquençage multiplex de l'ADN ancien pour l'analyse des SNP[J]. ADN ancien : Méthodes et Protocoles, 2019 : 141-147.