Directives de Soumission d'Échantillons
Questions et réponses sur le séquençage des petits ARN
Questions Générales
- La séquençage des petits ARN peut-il être effectué s'il n'y a pas de génome de référence pour l'espèce ?
- Le séquençage de petits ARN peut être effectué pour des espèces sans génome de référence, mais il est nécessaire de réaliser d'abord le découpage des transcrits sans transcriptome de référence et d'utiliser les transcrits comme séquences de référence pour l'analyse de séquençage de petits ARN.
- Pour les espèces sans génome de référence, comment effectuer un séquençage de petits ARN pour la prédiction des gènes cibles ?
- Nous vous suggérons de faire séquençage du transcriptome Pour découvrir des transcriptions à grande échelle, il faut construire une bibliothèque Unigene de l'espèce cible. Ensuite, sur cette base, un séquençage de petits ARN est effectué pour obtenir des petits ARN connus et prédire de nouveaux miARN par annotation, et la prédiction des gènes cibles est réalisée en les comparant avec les gènes de la bibliothèque Unigene, et enfin, l'annotation fonctionnelle des gènes cibles est complétée.
- Comment effectuer le contrôle qualité des bibliothèques de séquençage de petits ARN ?
-
La méthode de construction de la bibliothèque pour le séquençage des petits ARN utilisant l'Illumina Hiseq2000 est la suivante :
Purification par gel PAGE de petites molécules d'ARN de taille spécifique.
Ligation et purification de splices 5' (2).
Purification par ligation de splice 3' (3).
(4) Amplification par RT-PCR.
Purification de la bibliothèque de petits ARN.
-
La méthode de construction de la bibliothèque pour le séquençage des petits ARN utilisant l'Illumina Hiseq2000 est la suivante :
- Puis-je utiliser les résultats du séquençage de petits ARN pour analyser les tRNA ?
- Non, vous ne pouvez pas. L'ARN de transfert (ARNt) est un ARN non codant exprimé universellement, d'une longueur de 70 à 90 nucléotides (nt). L'ARNt possède une structure tertiaire stable et un haut degré de modification des bases, de méthylation, de réactions de translocation au sein des nucléosides et de réactions de réduction (nécessaires au fonctionnement de l'ARNt).
- Puis-je utiliser de l'ARN total pour préparer une bibliothèque de petits ARN ? Ou dois-je isoler ou enrichir les petits ARN comme échantillon de départ ?
- Des bibliothèques de petits ARN peuvent être préparées à partir d'ARN total. Il n'est pas nécessaire d'enrichir les petits ARN si la concentration de petits ARN est supérieure à 0,5 %, et il est recommandé d'utiliser de l'ARN total avec une valeur RIN supérieure à 7. Vous pouvez contactez-nous pour plus d'informations sur notre service de séquençage tRNA.
- Puis-je utiliser de l'ARN petit enrichi pour préparer une bibliothèque d'ARN petit ?
- Oui, vous pouvez utiliser de l'ARN petit enrichi, et si la quantité d'ARN petit enrichi est proche de 10 ng, diluez le mélange au taux de dilution recommandé de 100 ng d'ARN total comme décrit dans les instructions. Si la quantité d'ARN petit enrichi est proche de 100 ng, diluez le mélange au taux de dilution recommandé de 1 µg d'ARN total comme décrit dans les instructions.
- Comment effectuer une validation expérimentale après le séquençage des sRNA ?
-
Il existe plusieurs méthodes pour la validation expérimentale ultérieure des sRNA.
1. qPCR, qui vérifie l'expression des microARN.
2. Le RIP-seq, qui enrichit l'ARN avec une modification de méthylation ou l'ARN qui se lie spécifiquement à la protéine cible par la technologie RIP. Un séquençage à haut débit de l'ARN enrichi est effectué et comparé au génome pour obtenir des informations sur l'emplacement des microARN qui se lient spécifiquement à la protéine cible, etc.
Système de rapporteur de luciférase.
4. Construction de vecteurs de surexpression ou réduction de l'expression des gènes cibles.
-
Il existe plusieurs méthodes pour la validation expérimentale ultérieure des sRNA.
- Quelles sont les caractéristiques de notre service de séquençage des petits ARN ?
-
(1) Les petites molécules d'ARN peuvent être étudiées directement au niveau des nucléotides, sans les problèmes de réactivité croisée et de bruit de fond causés par les signaux de mimétisme fluorescent de l'hybridation traditionnelle sur microarray, facilitant la différenciation des différentes petites molécules d'ARN de la même famille ainsi que des séquences similaires.
(2) Permet une analyse à haut débit des espèces sans avoir besoin d'informations de séquence préalables ainsi que d'informations sur la structure secondaire.
(3) Une haute sensibilité et un débit de séquençage élevé fournissent une profondeur de données et une couverture pour la découverte et l'étude des petites molécules d'ARN et permettent la détection de transcrits rares à faible abondance.
(4) Les données brutes générées par le séquençage sont compatibles avec une variété de logiciels d'analyse, permettant l'annotation des informations génomiques des petits ARN et l'analyse de leurs niveaux d'expression, la possibilité d'annoter des petits ARN connus en utilisant la base de données des petits ARN, ainsi que la possibilité d'analyser davantage des données non appariées pour découvrir de nouvelles espèces et isoformes de petits ARN et trouver des informations pour des études plus approfondies.
-
(1) Les petites molécules d'ARN peuvent être étudiées directement au niveau des nucléotides, sans les problèmes de réactivité croisée et de bruit de fond causés par les signaux de mimétisme fluorescent de l'hybridation traditionnelle sur microarray, facilitant la différenciation des différentes petites molécules d'ARN de la même famille ainsi que des séquences similaires.
- Comment effectuer une analyse de signal brut du séquençage sRNA
-
(1) Contrôle de la qualité des données : La qualité des données de séquençage est un prérequis important pour la fiabilité des résultats d'analyse d'information. Les données brutes de sRNA doivent passer par des processus de contrôle de qualité tels que les séquences de jonction, l'élimination des séquences de bases contenant des N, l'élimination des séquences de bases de faible qualité, le filtrage par longueur, etc., afin d'obtenir des données de séquençage de haute qualité et de compter le nombre d'espèces de petits ARN et la distribution des longueurs.
(2) Alignement du génome de référence : À partir des lectures propres de chaque échantillon après le filtrage par longueur, les lectures sont alignées sur le génome de référence et les résultats de l'alignement sont comptabilisés.
(3) Analyse des miARN connus : les lectures sont comparées à la base de données des miARN pour identifier les microARN connus.
(4) Analyse des ARN non codants : comparer les lectures avec les séquences d'ARNnc des espèces ou la base de données Rfam pour identifier les rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA.
(5) Prédiction de nouveaux miARN : effectuer une prédiction de nouveaux miARN en utilisant miREvo et réaliser des analyses telles que la préférence de base et la structure secondaire.
(6) Expression génique et analyse différentielle : quantifier les miARN connus et les nouveaux miARN en fonction des résultats de comparaison, et effectuer une analyse différentielle des miARN pour obtenir les miARN différemment exprimés entre les échantillons ou les sous-groupes.
(7) Prédiction des gènes cibles des miARN : effectuer une prédiction différentielle des gènes cibles des miARN en utilisant à la fois les logiciels miRanda et RNAhybrid.
(8) Enrichissement fonctionnel : Sur la base des gènes cibles des miARN différentiels entre les échantillons ou sous-groupes, nous obtenons des informations fonctionnelles significativement enrichies grâce à des bases de données d'annotation fonctionnelle, telles que GO, KEGG, etc.
-
(1) Contrôle de la qualité des données : La qualité des données de séquençage est un prérequis important pour la fiabilité des résultats d'analyse d'information. Les données brutes de sRNA doivent passer par des processus de contrôle de qualité tels que les séquences de jonction, l'élimination des séquences de bases contenant des N, l'élimination des séquences de bases de faible qualité, le filtrage par longueur, etc., afin d'obtenir des données de séquençage de haute qualité et de compter le nombre d'espèces de petits ARN et la distribution des longueurs.
- S'il n'y a pas de séquence de génome, comment trouver les miARN pertinents et leurs gènes cibles ?
- La première méthode consiste à se référer à la littérature existante, par exemple, miR156 et miR172 jouent un rôle dans la croissance nutritionnelle et la croissance reproductive. Si le séquençage du génome n'est pas possible, alors le séquençage du transcriptome et le séquençage des petits ARN doivent être effectués pour analyser le transcriptome comme référence. Enfin, les séquences peuvent être soumises directement à certains logiciels en ligne tels que psRNATarget pour la prédiction des sites cibles.
- Lors de la réalisation du séquençage sRNA, quelles informations pertinentes dois-je fournir en plus de l'échantillon ?
- Le génome des espèces respectives ainsi que les informations pertinentes sur les exons, les introns et les répétitions sont nécessaires. Si le génome de l'espèce n'est pas disponible, des informations sur les espèces étroitement apparentées sont requises.
- Quelle est la longueur de lecture/étiquette pour le séquençage de petits ARN utilisant l'Illumina Hiseq2000 ? Quelle est la profondeur de couverture recommandée ?
- Pour le séquençage des petits ARN, les clients peuvent choisir la longueur des petits ARN qui les intéressent, qui est de 18 à 30 nt. Pour l'Illumina Hiseq2000, nous recommandons une longueur de séquençage de 35 pb, après quoi les informations de séquence sont tronquées pour enlever la séquence d'épissage et ne laisser que la séquence des petits ARN. Pour les études de découverte et d'analyse des petits ARN, nous ne recommandons pas la profondeur de couverture pendant le séquençage en raison de la nécessité d'effectuer une analyse d'expression des petits ARN. En général, au moins 5 millions de lectures sont acquises par échantillon, ce qui est suffisant pour garantir un séquençage précis.
- Quels facteurs affectent le séquençage des petits ARN ?
-
Les facteurs influençant le séquençage des sRNA sont principalement les suivants :
(1) La qualité de l'échantillon fourni par le client. Dans le processus de séquençage des petits ARN, les sRNA doivent être isolés, et la qualité et la pureté des petits ARN isolés affectent directement les résultats du séquençage. Étant donné que l'ARN se dégrade facilement, les opérations d'extraction et de purification de l'ARN doivent être effectuées strictement selon les exigences expérimentales pour garantir la qualité des échantillons.
(2) Qualité de la construction de la bibliothèque : La construction de la bibliothèque nécessite un gel PAGE pour séparer et purifier les petits ARN, puis relier la jonction pour purification avant la RT-PCR. Dans ce processus, une manipulation soigneuse est requise pour s'assurer que les petits ARN ne sont pas dégradés, et le processus de purification doit garantir que la jonction est éliminée proprement, car la jonction résiduelle aura un impact sur le séquençage ultérieur.
(3) Contrôle du volume de chargement de la bibliothèque de séquençage : Ce facteur affecte également dans une large mesure la densité de génération de clusters. Étant donné que le volume de chargement est très faible, seulement 1-8 pg, la capacité à quantifier avec précision des microsamples devient également un facteur important influençant le débit de séquençage.
-
Les facteurs influençant le séquençage des sRNA sont principalement les suivants :
Préparation des échantillons
- Quels types d'échantillons peuvent être traités par notre service de séquençage sRNA ?
-
Types d'échantillons : cellules, tissu frais, tissu FFPE, ARN sanguin, ARN de sérum ou de plasma, échantillons d'ARN exosomal, etc.
Espèces : humain, souris et ratdemander au support technique des détails sur des espèces spéciales).
-
Types d'échantillons : cellules, tissu frais, tissu FFPE, ARN sanguin, ARN de sérum ou de plasma, échantillons d'ARN exosomal, etc.
- Quels sont les types d'exigences d'échantillon pour le séquençage de petits ARN ?
-
(1) Exigence de pureté de l'échantillon : la valeur OD doit être comprise entre 1,8 et 2,2 ; le rapport 28S:18S doit être d'au moins 1,5 pour la détection par électrophorèse.
(2) Concentration de l'échantillon : la concentration totale d'ARN ne doit pas être inférieure à 200 ng/μL, veuillez ne pas utiliser la méthode d'extraction par colonne pour extraire l'ARN total, l'échantillon total ne doit pas être inférieur à 20 μg (ARN petit : ARN total > 0,3 %). Ou fournissez des échantillons d'ARN petit avec une concentration supérieure à 20 ng/μL et une quantité totale supérieure à 1 μg.
(3) Les échantillons de petits ARN doivent être conservés à -20°C ; veuillez fournir la concentration spécifique, le volume, le temps de préparation, le nom du solvant et l'origine des espèces des échantillons de petits ARN. Veuillez également inclure les données de contrôle qualité, y compris le graphique du gel d'électrophorèse, les données de détection par spectrophotométrie ou par instrument Nanodrop. Si plusieurs préparations d'échantillons sont nécessaires, veuillez fournir les échantillons requis pour plusieurs préparations d'échantillons.
(4) Transport des échantillons : Les échantillons doivent être transportés dans des tubes de 1,5 ml avec le nom de l'échantillon, la concentration et le temps de préparation indiqués sur le tube et scellés avec du Parafilm. Il est recommandé d'utiliser de la glace sèche pour l'expédition et d'opter pour un mode d'expédition plus rapide afin de réduire la possibilité de dégradation des échantillons pendant le transport.
-
(1) Exigence de pureté de l'échantillon : la valeur OD doit être comprise entre 1,8 et 2,2 ; le rapport 28S:18S doit être d'au moins 1,5 pour la détection par électrophorèse.
- Quelles sont les exigences spéciales pour l'extraction d'échantillons pour le séquençage de petits ARN ?
- Il est recommandé de ne pas utiliser les kits de colonne de Qiagen et d'autres entreprises ou la précipitation au LiCl pour éviter de perdre de petits fragments d'ARN. Si de petits échantillons d'ARN sont fournis directement, des kits spéciaux pour l'extraction de petits ARN peuvent être utilisés pour l'extraction.
- Pourquoi y a-t-il des séquences d'ARNr dégradées dans les résultats ?
- Étant donné que l'ARN total est souvent légèrement dégradé et qu'il existe un processus de dégradation naturel dans les organismes, les données contiendront un petit pourcentage de fragments d'ARNm dégradés. Cependant, ce pourcentage est généralement très faible et dépend de la qualité de l'échantillon d'ARN total.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
Services associés
