Protocole de séquençage d'ARN à cellule unique

Préparation des plaques de collecte

Nettoyage de l'espace de travail et préparations

1. Nettoyez la zone de travail avec de l'éthanol à 70 % (v/v) et des lingettes DNA-Off.
2. Décongelez des aliquotes des réactifs (tampon de lyse de cellules uniques) sur de la glace ou à 4°C.
3. Des supports en métal frais sur la glace ou à 4°C.
4. Une fois tous les réactifs décongelés, mélangez-les vigoureusement.

Placez la solution de lyse des cellules uniques dans les plaques.

1. Préparez le tampon de lyse des cellules uniques dans un tube microcentrifuge. Mélangez-le en inversant le tube au moins dix fois, puis récupérez le fond par une courte centrifugation dans un microfuge (5-10 secondes à moins de 1000 g). Évitez de vortexer la solution de lyse des cellules uniques car le détergent va mousser et emprisonner les cellules inutilement.
2. Assemblez les plaques de cadre PCR (quatre plaques de 24 puits par cadre pour une plaque de 96 puits) et placez-les sur un support en métal bien froid pour les refroidir.
Transférez 3 μL du tampon de lyse des cellules uniques dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux.
4. Scellez les plaques PCR. Collectez la solution de lyse au fond des puits par centrifugation pendant 15 secondes à <2000 g.
5. Gardez les assiettes sur de la glace pour une utilisation dans la journée.

Dissociation

Préparatifs

1. Une heure avant de commencer la dissociation, supplémenter la culture cellulaire avec 5 μM d'inhibiteur ROCK Y-27632. Il est inclus dans toutes les étapes suivantes pour prévenir l'apoptose pendant la dissociation et le traitement.
2. Préparez un tampon FACS suffisant, une dilution de travail de l'iodure TO-PRO-3, et une solution de blocage des pointes.
3. Préchauffez TrypLE Express complété avec 5 μM d'inhibiteur ROCK Y-27632.

Dissociation et coloration

1. Retirez délicatement le milieu des cellules cultivées dans des plaques à 12 puits à l'aide d'une micropipette.
2. Lavez doucement et sans agitation avec 2 mL de HBSS.
3. Ajoutez 0,5 mL de TrypLE Express supplémenté avec 5 μM d'inhibiteur ROCK Y-27632 par puits.
4. Incuber à 37°C sur un agitateur orbital à ≤100 rpm. Après 20 minutes, pipettez doucement les cellules de haut en bas 10 à 12 fois, suivi d'une incubation supplémentaire avec agitation. Répétez le pipetage toutes les 5 minutes jusqu'à obtenir une suspension de cellules uniques.
5. En attendant, ajoutez de l'iodure de TO-PRO-3 au tampon FACS pour obtenir une concentration finale de 1 μM (sauf pour le contrôle non teint).
6. Collectez les cellules et centrifugez à 200g pendant 4 minutes.
7. Pour le premier échantillon, incluez également les cellules fixées à l'éthanol et centrifugez-les également.
8. Resuspendre dans 300 μl de tampon FACS et filtrer à travers un capuchon de filtre FACS.
9. Maintenez la suspension de cellules uniques dans le tampon FACS sur glace.
10. Procédez à la FACS des cellules dans les 30 minutes.

Échantillon de contrôle de cellule morte teinté

1. Préparez de l'éthanol à 70 % frais avec de l'éthanol absolu et de l'eau distillée. Transférez 3 ml dans un tube FACS et refroidissez-le sur de la glace.
2. Dissociez les cellules avec TrypLE Express comme ci-dessus.
3. Resuspendre dans 5 ml de milieu et centrifuger à 200 g pendant 4 minutes.
4. Collecter les cellules dans 500 μl de HBSS.
5. Faites couler lentement la suspension cellulaire dans l'éthanol à 70 % glacé tout en vortexant vigoureusement le tube FACS pour éviter les agrégats cellulaires. Ne laissez pas les gouttes de suspension cellulaire tomber directement sur le plastique.
6. Laissez les échantillons sur de la glace pendant au moins 1 h pour les perméabiliser.
7. Le jour de la collecte des cellules unicellulaires, centrifugez et resuspendre les cellules fixées et perméabilisées dans 300 μL de tampon FACS avec l'iodure de TO-PRO-3.

Tri des cellules vivantes assisté par fluorescence (FACS)

Préparations et paramètres du cytomètre en flux

1. Boîte à glace avec les plaques de collecte préparées.
Boîte de glace carbonique avec support en métal refroidi pour la congélation instantanée des lysats de cellules uniques.
3. Centrifuge pour faire descendre les plaques de collecte.
4. Scellés adhésifs.
5. Glacière avec les échantillons.

Stratégie de tri

1. Dans allevents : Dans FSC-H×SSC-H, sélectionnez les cellules de la taille et de la granularité appropriées (gateP1) pour exclure les débris.
2. Depuis gateP1 : Dans FSC-A×FSC-W, sélectionnez les singlets (gateP2).
3. Depuis gateP2 : Dans SSC-A×SSC-W, sélectionnez à nouveau les singlets (gateP3).
4. Depuis gateP3 : Dans FSC-H×TO-PRO-3 iodure, séparez les somas vivants (gateP4) des somas morts, des corps apoptotiques et d'autres gros débris.

Collection

1. Depuis gateP4 (soma en direct), trier un événement (cellule) par puits, et dispenser un volume de 5 nL dans 3 μL de tampon de lyse.
2. Après avoir terminé de collecter une plaque, placez-la dans un support métallique glacé à l'intérieur de l'unité de flux laminaire, et scellez-la immédiatement avec un film de scellage.
3. Collectez les lysats au fond des puits par centrifugation pendant 15 secondes à <2000 g.
4. Place immédiatement la plaque sur un support en métal refroidi à l'azote solide pour congeler instantanément les lysats de cellules uniques.
5. Placez les plaques dans un sac zip-lock refroidi sur de la glace carbonique.
6. Conserver à -80°C jusqu'au traitement des lysats.

Bibliothèques cDNA Smart-Seq2 à cellule unique

Préparations

1. Nettoyez la zone de travail avec de l'éthanol à 70 % et des lingettes.
2. Décongelez des aliquotes de réactifs sur de la glace.
3. Des étagères en métal froid sur de la glace.
4. Une fois tous les réactifs décongelés, mélangez vigoureusement.

Synthèse du premier brin

1. Préparez le mélange de réaction pour la synthèse du premier brin. Inversez le tube et récupérez par une centrifugation rapide dans un microfuge.
2. Réglez le thermocycleur à 72°C.
3. Placez les lysats congelés sur un support en métal froid. Fermez le couvercle en plastique à l'aide d'une spatule.
4. Centrifugez pendant 15 secondes à <2000 g et récupérez les lysats cellulaires au fond.
5. Retirez les bandes de tubes PCR de la plaque à 96 puits. Les bandes sont maintenues ensemble par le sceau en plastique. Scellez hermétiquement et coupez l'excès de bord du sceau en plastique.
6. Placez les tubes dans un thermocycleur, mettez le couvercle et incubez à 72°C pendant 3 minutes. C'est l'étape de dénaturation de la transcription inverse.
7. Remettez les tubes PCR dans la plaque à 96 puits. Refroidissez immédiatement sur de la glace pendant au moins 2 minutes.
8. Pendant que les échantillons refroidissent, démarrez le programme de thermocycleur "1_RT_10" pour chauffer à 42°C.
9. Collectez les échantillons par centrifugation brève. Retirez le sceau avec précaution et placez la plaque encadrée Piko PCR sur un support en métal froid.
10. Distribuez le mélange de réaction de première chaîne dans une bande de huit puits (36,5 μL par puits). Ajoutez 2,76 μL de mélange de réaction de première chaîne sur le côté de chaque puits contenant le lysat de cellule unique à l'aide d'une pipette multicanaux.
11. Scellez la plaque encadrée de PCR.
12. Combinez la réaction de synthèse du premier brin avec les lysats par centrifugation pendant 15 secondes à <2000 g.
13. Scellez l'assiette avec un couvercle en plastique.
14. Retirez les bandes de tubes PCR de la plaque à 96 puits. Les bandes sont maintenues ensemble par le sceau en plastique.
15. Scellez hermétiquement et coupez l'excès de bord du sceau en plastique.
16. Placez la plaque dans le thermocycleur et ajoutez le couvercle.
17. Exécutez le programme "1_RT_10".

Synthèse et amplification de la seconde brin

1. Préparez le mélange de réaction pour la synthèse du deuxième brin sur glace dans un tube microfuge. Mélangez le mélange de réaction pour la synthèse du deuxième brin par inversion, puis recueillez par centrifugation pendant 15 secondes à <2000 g.
2. Distribuez le mélange de réaction de la deuxième chaîne dans une bande de huit puits (100 μL par puits) comme réservoir pour la pipette.
3. Retirez les échantillons de la réaction de synthèse du premier brin du thermocycleur. Placez immédiatement les bandes de tubes PCR Piko dans le cadre de la plaque à 96 puits et sur un support métallique glacé.
4. Démarrez le programme de thermocycleur "2_ISP_21".
5. Scellez avec une feuille de couverture en plastique et collectez les réactions par centrifugation brève pendant 15 secondes à <2000 g. Placez la plaque encadrée Piko PCR sur un support métallique froid, et retirez soigneusement le sceau.
Ajoutez 7,5 μL de mélange de réaction pour le deuxième brin sur le côté de chaque puits contenant les échantillons à l'aide d'une pipette multicanaux.
7. Scellez la plaque PCR encadrée. Combinez la réaction par une brève centrifugation pendant 15 secondes à <2000 g.
8. Retirez les bandes de tubes PCR de la plaque encadrée. Les bandes sont maintenues ensemble par le sceau en plastique. Scellez hermétiquement et coupez l'excès de bord du sceau en plastique.
9. Placez les tubes de réaction de la deuxième chaîne dans le thermocycleur, ajoutez le couvercle et lancez le programme "2_ISP_21" (poursuivez jusqu'à la deuxième étape). C'est l'étape de synthèse et d'amplification de la deuxième chaîne.

Purification de la bibliothèque cDNA

1. Équilibrer les billes SPRI (19,5 % PEG-8k) à température ambiante pendant au moins 20 minutes.
2. Distribuez les billes magnétiques dans une bande de huit puits (220 μL par puits).
3. Colonne par colonne, ajoutez 12,5 μL de billes par puits dans une plaque à 96 puits à fond profond en utilisant une pipette multicanaux.
4. Retirez les échantillons du thermocycleur. Placez les bandes de tubes PCR Piko dans le cadre de la plaque à 96 puits et sur un support métallique glacé.
5. Scellez la plaque avec un couvercle en plastique et collectez la réaction par centrifugation brève pendant 15 secondes à <2000 g. Retirez le sceau avec précaution et placez la plaque à 96 puits sur un support en métal froid.
6. Colonne par colonne, à l'aide d'une pipette multicanaux, transférez les échantillons dans les plaques à puits profonds avec les billes magnétiques. Après chaque transfert, mélangez les billes et la réaction en pipetant de haut en bas 10 fois.
7. Après le dernier transfert, couvrez les échantillons et incubez à température ambiante pendant 8 minutes pour permettre aux billes magnétiques de se lier aux échantillons.
8. Placez la plaque couverte avec les échantillons sur un support magnétique pour collecter les billes pendant 5 minutes.
9. Jetez le surnageant sans perturber les billes. Séchez les billes pendant 10 minutes à température ambiante sans couvercle pendant que la plaque est toujours sur le support magnétique.
10. Distribuez la solution d'élution dans une bande de huit puits (160 μL par puits) comme réservoir pour la pipette multicanaux. Pendant que les échantillons sont encore sur le support magnétique, ajoutez 13 μL de solution d'élution par puits.
11. Retirez la plaque du support magnétique. Colonne par colonne, resuspendez les billes dans la solution d'élution en pipetant de haut en bas 10 fois.
12. Couvrez la plaque de puits profonds et incubez-la à température ambiante pendant 5 minutes pour libérer les échantillons des billes.
13. Placez la plaque à puits profonds sur le support magnétique et liez les billes pendant plus de 2 minutes.
Étiquetez 12 bandes à huit puits à faible liaison aux acides nucléiques et placez-les sur un support en métal froid.
15. Colonne par colonne, transférez 12 μL de l'éluate de la plaque sur le support magnétique vers des bandes de huit puits.
Lors du transfert, ne dérangez pas les billes. Après le transfert et la prise d'échantillons pour la quantification, scellez les bandes à huit puits et congelez à -20°C.

Quantification et contrôle de qualité des bibliothèques cDNA à cellule unique

Quantification de la bibliothèque cDNA à cellule unique

1. Pipette 49 μL de solution d'essai par puits dans des plaques d'essai noires à 96 puits pour les échantillons. Gardez les plaques d'essai dans l'obscurité.
2. Collectez les bibliothèques de cDNA à cellule unique par centrifugation des plaques de stockage pendant 15 secondes à <2000 g. Retirez soigneusement la feuille de scellement.
3. Colonne par colonne, transférez 1 μL de chaque bibliothèque de cDNA à cellule unique directement dans la solution d'essai dans une plaque d'essai noire. Gardez la plaque d'essai dans l'obscurité.
4. Après avoir terminé le transfert, scellez la plaque de stockage avec les bibliothèques cDNA à cellule unique. Récupérez-les au fond du puits par centrifugation des plaques de stockage pendant 15 secondes à <2000 g, et conservez-les à -20°C.
5. Préparez les standards pour l'étalonnage de l'essai. Placez 47,5 μL de solution d'essai par puits et ajoutez 2,5 μL des standards. Nous utilisons quatre réplicats de chaque standard 1 (0 ng/μL dsDNA, fond) et standard 2 (10 ng/μL dsDNA, limite supérieure).
6. Après avoir préparé les deux échantillons et les standards, nous mesurons le signal de fluorescence dans un spectrofluoromètre (excitation à 485 nm/émission à 530 nm). La concentration de la bibliothèque cDNA à cellule unique est calculée selon l'équation suivante avec le facteur de dilution f._Dilution=50 et les valeurs moyennes des normes.
7. Après avoir terminé les mesures, jetez les plaques d'essai.

Contrôle de qualité de l'ADNc

Pour chaque pool de cDNA à cellule unique, préparez une bande de huit tubes.
2. Collectez les bibliothèques de cDNA à cellule unique par centrifugation des plaques de stockage pendant 15 secondes à <2000 g. Retirez soigneusement la feuille de scellage.
3. Colonne par colonne, combinez 1 μL de chaque bibliothèque cDNA à cellule unique dans une bande de huit tubes.
4. Après avoir terminé le transfert, scellez la plaque de stockage avec les bibliothèques de cDNA à cellule unique. Récupérez-les au fond du puits par centrifugation des plaques de stockage pendant 15 secondes à <2000 g, et conservez-les à -20°C.
5. Combinez le contenu de chaque tube de la bande de huit tubes dans un seul tube. Il s'agit de l'échantillon de bibliothèque cDNA à cellules uniques regroupé pour le profilage sur le Bioanalyzer.
6. Suivez les instructions du kit d'ADN à haute sensibilité (ou similaire) et analysez les traces de profil cDNA.

Référence :

1. Schweingruber C, Nijssen J, Benitez J A, et al. Séquençage d'ARNm à cellule unique de neurones humains dérivés in vitro utilisant Smart-Seq2[M]//Réseaux de régulation des facteurs de transcription. Humana, New York, NY, 2023 : 143-164.