Séquençage de l'ARN 5-Méthylcytosine (m5C) par le protocole Illumina

Extraction, purification et traitement par DNase de l'ARN

L'ARN total est extrait et purifié directement à partir de tissu avec 1 mL de TRIzol™ conformément au protocole du fabricant. L'ARN est ensuite traité avec de la DNase TURBO™ selon le protocole du fabricant. Évaluez l'intégrité de l'ARN en utilisant une puce RNA 6000 Nano sur l'Agilent 2100 Bioanalyzer conformément au protocole du fabricant.

Génération du contrôle de transcript MGFP in vitro Spike-in

1. Linéarisez le vecteur phMGFP en utilisant l'enzyme de restriction XbaI et purifiez l'ADN vectoriel linéarisé selon le protocole du kit de transcription in vitro HiScribe T7.
2. Effectuez une transcription in vitro selon le protocole du kit de transcription in vitro HiScribe T7 en utilisant 1 μg d'ADN linéarisé. Un temps d'incubation de 4 heures à 37 °C avec les composants du kit est suffisant.
Ajoutez 2 U de TURBO™ DNase et incubez à 37 °C pendant 30 minutes.
4. Transférez la réaction dans un tube Phase Lock Gel™ et complétez le volume de la réaction à 100μL avec de l'eau ultrapure.
5. Ajoutez un volume égal de phénol:eau et de chloroforme, agitez vigoureusement pendant 15 secondes, puis centrifugez à 15 000 × g pendant 5 minutes.
6. Ajoutez le même volume de chloroforme que dans l'étape 5 au tube, secouez vigoureusement pendant 15 secondes, puis centrifugez à 15 000 × g pendant 5 minutes à nouveau.
7. Transférez la phase aqueuse dans un tube propre de 1,5 mL. Ajoutez 1/10 du volume de l'acétate de sodium 3 M, 3 volumes d'éthanol à 100 % et 1 μL de glycogène ; vortexez ; et précipitez l'ARN pendant la nuit à −80 °C.
8. Centrifugez l'ARN à 17 000 × g à 4 °C pendant 60 minutes et retirez soigneusement le surnageant.
Ajoutez 1 mL d'éthanol à 75 % à l'ARN, inversez cinq fois et centrifugez à 7500 × g à 4 °C pendant 10 minutes.
10. Retirez soigneusement le surnageant et laissez le culot sécher à l'air pendant environ 15 minutes.
11. Resuspendre l'ARN dans 25μL d'H ultrapure.₂O.
12. Étape facultative : Traiter 5 μg de transcript MGFP transcrit in vitro avec 2 U de TURBO™ DNase selon le protocole du fabricant à 37 °C pendant 30 minutes.
13. Évaluer l'intégrité et la taille des transcrits MGFP in vitro en utilisant une puce Nano RNA 6000 sur l'Agilent 2100 Bioanalyzer conformément au protocole du fabricant.

Conversion de l'ARN par bisulfite

Ajoutez 1/2000 de la transcriptase ARN MGFP à 2μg d'ARN total purifié traité par DNase. Augmentez le volume de l'échantillon d'ARN à 20μL avec de l'eau ultrapure.
2. Dénaturez l'ARN en le chauffant à 75 °C pendant 5 minutes dans un bloc chauffant.
3. Préchauffez la solution de bisulfite de sodium à 75 °C, ajoutez 100 μL à l'ARN, vortexez soigneusement et centrifugez brièvement dans une microcentrifugeuse (13 000 × g pendant 1 min).
4. Recouvrir le mélange réactionnel avec 100μL d'huile minérale. Couvrir le tube avec du papier aluminium pour protéger le mélange réactionnel de la lumière.
5. Incuber à 75 °C pendant 4 h dans un bloc chauffant.
6. Environ 15 minutes avant que la réaction de conversion au bisulfite ne soit terminée, préparez deux colonnes Micro Bio-Spin pour chaque réaction de conversion en laissant la solution de Tris dans la colonne s'écouler dans un tube de collecte. Jetez le fluide de Tris, replacez la colonne dans le tube de collecte et centrifugez à 1000 × g pendant 2 minutes. Transférez chaque colonne dans un tube propre de 1,5 mL.
7. Retirez le mélange de réaction de bisulfite du bloc chauffant et transférez délicatement la couche aqueuse (qui se trouve sous l'huile minérale) contenant le mélange de bisulfite de sodium/ARN dans la colonne Micro Bio-Spin.
8. Centrifugez à 1000 × g pendant 4 minutes.
9. Transférez soigneusement l'éluté dans la deuxième colonne Micro Bio-Spin placée dans un tube de 1,5 mL et répétez l'étape 8.
10. Préchauffez la température du bloc de chaleur à 75 °C en préparation de l'étape 12.
11. Ajoutez un volume égal de Tris–HCl 1 M pH 9,0 au deuxième eluate, vortexez, centrifugez brièvement, puis recouvrez avec 175 μL d'huile minérale. Couvrez le tube avec du papier aluminium pour protéger le mélange réactionnel de la lumière.
12. Incuber à 75 °C pendant 1 h dans le bloc chauffant.
13. Transférez la couche aqueuse inférieure contenant l'ARN dans un tube propre de 1,5 mL.
14. Précipitez l'ARN traité au bisulfite et resuspendre l'ARN converti au bisulfite dans H.₂O.

Conception d'amorces d'oligonucléotides bisulfites pour la synthèse d'ADNc et la PCR

1. Pour une amplification parallèle efficace de 48 amplicons cibles sur le Fluidigm Access Array, utilisez la synthèse de cDNA ciblée pour réduire l'amplification d'amplicons spurious. La synthèse de cDNA ciblée est réalisée en concevant des amorces de transcriptase inverse (RT) 30 à 40 nt en 3' des cytosines à analyser.
2. Concevez des amorces pour le premier tour d'amplification PCR de sorte que les petits amplicons mesurent entre 170 et 200 pb, afin de permettre une amplification efficace. Étant donné que la teneur en G/C dans le modèle est faible, concevez des amorces longues pour garantir qu'une Tm se situe dans la plage de 59 à 61 °C. Ajoutez la séquence CS1 (5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-3') à l'amorce avant de la séquence spécifique au gène (GSS) et CS2 (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACA-3') à l'amorce inverse GSS. Pour la deuxième amplification PCR, utilisez l'amorce avant contenant les séquences complémentaires à la cellule de flux P5 d'Illumina combinée avec CS1 (P5_CS1) et l'amorce inverse contenant le code-barres et les séquences complémentaires à la cellule de flux P7 d'Illumina combinée avec CS2 (P7_BC_CS2).

Synthèse d'ADNc

1. Mélangez 500 ng d'ARN converti par bisulfite, 1 μL de mélange de dNTP à 1 mM et 2 μL de mélange de primers en pool à 10×, puis ajoutez de l'eau ultrapure H.₂O à un volume final de 13 μL. Incuber le mélange à 65 °C pendant 5 minutes pour dénaturer l'ARN.
2. Transcrire à l'envers l'ARN converti par bisulfite en utilisant la transcriptase inverse SuperScript™ III selon le protocole du fabricant. Ajouter soit des amorces RT 48 en pool pour une amplification parallèle de l'Access Array, soit des hexamères aléatoires pour des amplicons PCR uniques.
3. Après la réaction, diluez les cDNAs 1:10 dans de l'eau ultrapure H.₂O pour l'amplification PCR.

Amplification, quantification et mise en commun PCR individuelles

1. Pour un PCR de 10μL, ajoutez 0,2μL de KAPA HiFi ADN polymérase, 2μL de tampon de fidélité HiFi 5× (avec MgCl2), 0,3μL de dNTP à 10 mM, 0,4μL de primer avant à 10μM (CS1_GSS), 0,4μL de primer arrière à 10μM (CS2_GSS), 1μL de cDNA dilué, et de l'H2O pour un volume final de 10μL. Effectuez le PCR pour chaque amplicon en triplicat.
2. Agitez doucement par vortex, centrifugez brièvement et placez dans un cycler thermique préchauffé.
3. Effectuer un programme de PCR à deux étapes de cyclage thermique.
4. Regroupez les triplicats et effectuez un nettoyage avec des billes AMPure à un ratio de 1,8:1 pour éliminer les amorces non incorporées et les dimères d'amorces. Répétez cette étape.
5. Évaluer la taille et la concentration des amplicons PCR après séparation sur un système d'électrophorèse sur microchip Shimadzu MCE®-202 MultiNA.
6. Normalisez la concentration de chaque amplicon dans l'expérience par dilution avec de l'H2O à une concentration dans la plage de 0,5 à 5 ng/μL.
7. Effectuez la PCR de barcoding et d'ajout d'adaptateurs Illumina. Dans une PCR de 10μL, ajoutez 0,2μL de KAPA HiFi ADN polymérase, 2μL de tampon HiFi Fidelity 5× (avec MgCl2), 0,3μL de dNTP à 10 mM, 1μL de primer avant à 10μM (P5_CS1), 1μL de primer arrière à 10μM (P7_CS2), 2μL d'amplicon PCR dilué, et H2O jusqu'à un volume final de 10μL.
8. Agitez doucement par vortex, centrifugez brièvement et placez dans un cycler thermique préchauffé.
9. Effectuez un programme de PCR à deux étapes de cyclage thermique.
10. Évaluer la taille et la concentration des amplicons PCR après séparation sur un système d'électrophorèse sur microchip Shimadzu MCE®-202 MultiNA.
11. Regroupez les amplicons à une concentration équimolaire et purifiez-les en utilisant des billes AMPure conformément au protocole du fabricant. Utilisez un rapport de billes par rapport aux amplicons regroupés de 0,9:1 pour garantir la liaison des amplicons et non des dimères de primers ou des primers non incorporés.
12. Estimez d'abord la concentration en ADN à l'aide d'un kit d'évaluation de l'ADN dsDNA à large gamme Qubit selon le protocole du fabricant. Ensuite, évaluez avec précision la concentration en ADN en utilisant le KAPA Library Quantification Kit pour les plateformes Illumina®. Effectuez une dilution en série des amplicons regroupés de manière à ce qu'ils se situent dans la plage dynamique de l'essai de 5,5 à 0,000055 pg/μL.

Séquençage MiSeq

1. Préparez la feuille d'échantillons en utilisant le gestionnaire d'expériences Illumina en suivant le protocole du fabricant.
2. Diluez la bibliothèque à 10 nM dans le tampon EBT en fonction des concentrations déterminées par le qPCR. À partir de ce moment, gardez les bibliothèques sur glace.
3. Diluez la bibliothèque de contrôle PhiX à 2 nM en ajoutant 8 μL de tampon EBT à 2 μL de la bibliothèque de contrôle PhiX à 10 nM.
4. Dénaturez les bibliothèques regroupées et la bibliothèque de contrôle PhiX séparément en ajoutant 10μL de NaOH à 0,2 M à 10μL des bibliothèques à 2 nM.
5. Vortexez soigneusement pour mélanger et centrifugez à 1000 × g pendant 30 s. Incubez à température ambiante pendant 5 min.
6. Diluez séparément les bibliothèques en pool dénaturées et la bibliothèque de contrôle PhiX à 20 pM en ajoutant 980 μL de HT1 pré-refroidi à 20 μL de bibliothèques dénaturées.
7. Diluez les bibliothèques groupées à 20 pM et la bibliothèque de contrôle PhiX séparément à 10 pM en ajoutant 500 μL de HT1 pré-refroidi à 500 μL de bibliothèques à 20 pM.
Combinez 100μL de la bibliothèque de contrôle PhiX à 10 pM avec 900μL des bibliothèques en pool à 10 pM et vortexez pour mélanger.
9. Charge 600μL de l'échantillon final dans la cartouche. Assurez-vous que les bulles d'air sont éliminées en tapotant doucement la cartouche.
10. Effectuez la course de séquençage selon le protocole du fabricant.

Référence :

1. Li J, Wu X, Do T, et al. Profilage quantitatif et à résolution de nucléotides uniques de la 5-méthylcytosine de l'ARN[M]//Modifications de l'ARN. Humana, New York, NY, 2021 : 135-151.