Directives de Soumission d'Échantillons
Questions et réponses sur le séquençage RIP
Questions Générales
- Quelles informations devrais-je connaître avant de réaliser le RIP-Seq ?
- Avant de réaliser un RIP-SEQ, vous devez généralement spécifier
• Le type d'échantillon à réaliser
• Quels RBP sont d'intérêt
• Que des anticorps au niveau de l'IP sont disponibles pour ces RBP ?
• Le type de séquences d'ARN liées par les RBP d'intérêt (par exemple, ARNm, miARN, lncARN, circARN, etc.)
- Avant de réaliser un RIP-SEQ, vous devez généralement spécifier
- Quels sont les critères de sélection des IP endogènes pour le séquençage RIP ?
- En général, pour l'IP endogène, certaines conditions nécessaires doivent être remplies : (i) il doit y avoir un anticorps de qualité IP ; (ii) la quantité de protéine de départ doit être suffisamment importante.
- Comment choisir l'anticorps pour le RIP ?
- Pour la faible abondance de liaison des protéines et de l'ARN, l'efficacité de l'IP n'est généralement pas très élevée, la quantité d'ARN est faible et il y a un risque plus important lors de la construction de la bibliothèque, donc vous pouvez choisir plusieurs IP pour augmenter la quantité de produit.
- Pourquoi WB effectue-t-il une évaluation pré-expérimentale avant l'expérience RIP ?
- Les principaux objectifs du Western Blot sont (i) de détecter la spécificité de l'anticorps et s'il peut se lier à la protéine cible ; (ii) d'identifier les bandes de la protéine cible par spectrométrie de masse ; et (iii) de détecter si la protéine cible est exprimée dans l'échantillon et son niveau d'abondance.
- Mon anticorps a une bande de protéine cible pour le WB, mais pourquoi pas de bande pour le RIP ?
- Il existe de nombreux immunoessais avec des objectifs différents, tels que WB, ELISA, IP, IF, ChIP, IHC(P), FACS, parmi lesquels seul le WB est un test qui nécessite la dénaturation des protéines. Dans ce cas, tout anticorps dirigé contre cette protéine peut reconnaître l'antigène qui devient linéaire dans le WB ; cependant, les anticorps pouvant être utilisés pour le WB ne peuvent pas être utilisés pour des tests non dénaturants tels que l'IP, l'IF et l'IHC, car la structure tridimensionnelle des protéines naturelles cache de nombreux sites de liaison pour les anticorps, et les anticorps de niveau WB ne peuvent pas s'y lier.
Pour réaliser des expériences de RIP, vous devez acheter des anticorps de niveau IP.
- Il existe de nombreux immunoessais avec des objectifs différents, tels que WB, ELISA, IP, IF, ChIP, IHC(P), FACS, parmi lesquels seul le WB est un test qui nécessite la dénaturation des protéines. Dans ce cas, tout anticorps dirigé contre cette protéine peut reconnaître l'antigène qui devient linéaire dans le WB ; cependant, les anticorps pouvant être utilisés pour le WB ne peuvent pas être utilisés pour des tests non dénaturants tels que l'IP, l'IF et l'IHC, car la structure tridimensionnelle des protéines naturelles cache de nombreux sites de liaison pour les anticorps, et les anticorps de niveau WB ne peuvent pas s'y lier.
- Y a-t-il des expériences de contrôle qualité qui doivent être réalisées après l'immunoprécipitation dans les expériences de RIP ?
- Après immunoprécipitation, d'une part, les protéines enrichies sont soumises à un contrôle de qualité par WB pour tester la spécificité de l'IP et l'effet d'enrichissement de la protéine cible. D'autre part, l'ARN doit être extrait pour une analyse quantitative et la bibliothèque de séquençage construite doit être vérifiée pour sa qualité.
- À quoi dois-je faire attention dans les expériences RIP ?
- 1. Prévenir la liaison non spécifique de l'ARN aux protéines
2. Éviter la perturbation de la liaison ARN-protéine
3. Éviter la contamination par des RNases exogènes
4. Inhiber l'activité de l'ARNase endogène
5. Sélectionnez des anticorps adaptés pour le RIP
6. Éviter la dégradation des protéines liant l'ARN.
- 1. Prévenir la liaison non spécifique de l'ARN aux protéines
- Comment évaluer les résultats de contrôle qualité du WB après les expériences RIP ?
- 1. Si la protéine cible est exprimée dans l'échantillon et que l'anticorps est efficace, la protéine cible peut être détectée dans l'échantillon et l'Input produit une bande à la position correspondante.
2. Si l'anticorps utilisé peut effectivement enrichir la protéine cible, alors l'IP produira également une bande à la position correspondante ; de plus, il y aura également des bandes d'anticorps, dues au fait que l'anticorps est fortement lié à la protéine et ne peut pas être séparé avant le chargement de l'échantillon, et la chaîne lourde (ou la chaîne légère) de l'anticorps conjugué à l'anticorps secondaire marqué par l'enzyme ajoutée lors du contrôle qualité WB produira une bande à 55 kD (ou 25 kD).
3. L'IgG peut nous aider à déterminer si le système d'immunoprécipitation présente une liaison non spécifique à la protéine ou non, et le résultat de la RIP avec une haute spécificité ne devrait pas montrer de bande de destination et uniquement la bande de chaîne lourde (ou légère) de l'IgG.
- 1. Si la protéine cible est exprimée dans l'échantillon et que l'anticorps est efficace, la protéine cible peut être détectée dans l'échantillon et l'Input produit une bande à la position correspondante.
- Comment découvrir les miARN par séquençage RIP et étudier pour prédire leur fonction ?
- Les miARN peuvent réguler des processus cellulaires liés à la fonction neuronale, y compris la formation de neurosynapses. Nous prenons l'exemple de l'étude des miARN dans les neurones. En construisant un vecteur marqué par GFP et en l'injectant dans les cerveaux de souris, nous avons obtenu des miARN et des ARNm cibles en utilisant la RIP ; et vérifié l'efficacité de la RIP par qRT-PCR. Ensuite, les fragments d'ARN obtenus par RIP ont été séquencés en haute capacité et comparés respectivement au génome de référence des souris et à la base de données miRbase pour l'annotation et l'analyse d'enrichissement des fonctions GO, etc. afin de découvrir les fonctions des miARN.
- L'ARN enrichi en IP est-il l'ARN lié à la protéine cible ?
- Pas exactement, le RIP enrichit l'ARN de liaison à la protéine cible, donc la couverture des lectures de séquençage est plus élevée dans les régions de liaison à la protéine du génome de référence, formant des pics évidents par rapport à d'autres régions. Cependant, en raison des différences d'expression de l'ARN et des préférences introduites par les processus d'amplification et de séquençage, la couverture des lectures dans les régions non enrichies peut également présenter des pics hauts et bas, ce qui interfère sans aucun doute avec le dépistage des pics de liaison (appel de pics).
Préparation des échantillons
- Comment stocker les échantillons pour le RIP-seq ?
- Après que les échantillons ont été isolés, rapidement nettoyés et étiquetés, ils doivent être immédiatement congelés par choc dans de l'azote liquide pendant au moins 30 minutes, puis stockés dans un réfrigérateur à -80°C ou dans de la glace carbonique pour s'assurer que les échantillons restent toujours à -80°C avant l'opération expérimentale afin d'éviter la dégradation des protéines.
- L'ARN extrait peut-il être utilisé pour des expériences de RIP ?
- Bien sûr que non, car le RIP-Seq est réalisé en isolant la protéine liant l'ARN (RBP) avec un anticorps spécifique, qui se lie à la séquence d'ARN, puis la séquence d'ARN liée est mesurée. Il n'y a plus de RBP dans l'ARN total extrait.
- Quelle est la quantité de tissu animal prélevée pour le RIP-seq ? Et comment échantillonner ?
- Tissus animaux
1. Retirer les tissus frais, ce qui devrait exclure les types de tissus non requis pour l'étude, tels que les tissus conjonctifs et adipeux.
2. Rincez rapidement la surface du tissu avec une solution saline à 0,9 % pré-refroidie pour éliminer tout résidu de sang.
3. Si le tissu est volumineux, essayez de le couper en petits morceaux de ≤ 0,5 cm de longueur, de largeur et de hauteur (c'est-à-dire de la taille d'un soja).
4. Mélangez bien les échantillons de tissu traités et conservez-les dans un tube de lyophilisation à bouchon à vis d'une capacité de 10 ml ou plus, étiqueté avec précision.
5. Placer rapidement dans de l'azote liquide pendant 30 minutes, puis transférer à -80°C ou dans de l'azote liquide pour le stockage.
6. Transport : Placer les tubes lyophilisés dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml ou dans des sacs en plastique bien scellés et transporter sur de la glace carbonique.
La taille de l'échantillon pour les tissus animaux
1. Animaux individuels plus petits tels que des souris, des poussins, des poissons-zèbres, etc. foie, cœur, cerveau et autres tissus : >1g.
2. Animaux individuels plus grands tels que les porcs, le bétail, les moutons, etc. muscle, embryon tardif et autres tissus : >2g de tissu adipeux >10g.
3. Individus entiers tels que les insectes : >3g.
- Tissus animaux
- Si vous étudiez des échantillons de tumeurs, quelles sont les exigences d'échantillonnage pour le RIP-Seq ?
- 1. Pour les tissus tumoraux, les tissus tumoraux et normaux doivent être déterminés aussi précisément que possible, et si possible, veuillez juger le site de prélèvement à étudier en fonction des résultats du rapport de coupe congelée, et les tissus tumoraux doivent être excisés des tissus normaux environnants (les tissus normaux doivent également être excisés des tissus tumoraux environnants).
2. Immédiatement après l'isolement, divisez le tissu, d'environ 2-3 mm d'épaisseur, et placez le tissu dans un tube de lyophilisation à vis de 2,0 ml ou de volume supérieur.
3. Congeler rapidement dans de l'azote liquide pendant 30 minutes, puis transférer à -80°C ou dans de l'azote liquide pour le stockage.
4. Transport : Placez les tubes lyophilisés dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml ou de petits sacs en plastique bien hermétiques et transportez-les sur de la glace sèche.
Tissu tumoral : >1 g.
- 1. Pour les tissus tumoraux, les tissus tumoraux et normaux doivent être déterminés aussi précisément que possible, et si possible, veuillez juger le site de prélèvement à étudier en fonction des résultats du rapport de coupe congelée, et les tissus tumoraux doivent être excisés des tissus normaux environnants (les tissus normaux doivent également être excisés des tissus tumoraux environnants).
- Les tissus végétaux peuvent-ils être utilisés pour le RIP-SEQ ? Combien d'échantillons de plantes dois-je fournir ?
- Les rendements d'enrichissement en PI sont faibles, et la construction de la bibliothèque peut échouer si la quantité de départ requise n'est pas atteinte. En particulier pour les tissus végétaux, la quantité d'échantillons envoyés doit être garantie car les feuilles, fruits, tubercules ou rhizomes des plantes contiennent de fortes concentrations de substances polysaccharidiques polyphénoliques, ainsi que d'autres composants complexes inconnus, qui sont difficiles à extraire.
1. Des tissus frais sont prélevés sur le corps de la plante. Pour le matériel obtenu sur le terrain, la poussière ou le sol à la surface du matériel doit être rincée et essuyée après extraction.
2. Si le tissu est volumineux, il doit être découpé en petits morceaux autant que possible, puis placé dans un tube de lyophilisation de 10 ml ou d'un volume supérieur, ou enveloppé hermétiquement dans du papier aluminium et placé dans un sac auto-adhésif, étiqueté avec précision.
3. Placer rapidement dans de l'azote liquide pendant 30 minutes, puis transférer à -80°C ou dans de l'azote liquide pour le stockage.
4. Volume d'échantillon. Souche : >5g. Système racinaire : >5g. Tiges : >5g. Feuilles : >5g. Fruits : >10g. Graines : >5g. Inflorescence, étamines, pollen : >2g.
- Les rendements d'enrichissement en PI sont faibles, et la construction de la bibliothèque peut échouer si la quantité de départ requise n'est pas atteinte. En particulier pour les tissus végétaux, la quantité d'échantillons envoyés doit être garantie car les feuilles, fruits, tubercules ou rhizomes des plantes contiennent de fortes concentrations de substances polysaccharidiques polyphénoliques, ainsi que d'autres composants complexes inconnus, qui sont difficiles à extraire.
- Mon échantillon est une cellule, que dois-je faire avant de procéder à la livraison du séquençage RIP ?
- 1. Les cellules en culture adhérente doivent être traitées en suspension cellulaire et lavées deux fois avec un tampon PBS (préparé sans Rnase), centrifugées à 3 000 tr/min, à 4 °C pendant 5 minutes, le surnageant étant éliminé et étiqueté avec précision.
2. Congeler rapidement dans de l'azote liquide pendant 30 minutes, puis transférer à -80 °C ou conserver dans de l'azote liquide.
3. Transport : placez les tubes lyophilisés dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml ou dans de petits sacs en plastique bien hermétiques et transportez-les sur de la glace carbonique.
4. Taille de l'échantillon : 1 x 108.
- 1. Les cellules en culture adhérente doivent être traitées en suspension cellulaire et lavées deux fois avec un tampon PBS (préparé sans Rnase), centrifugées à 3 000 tr/min, à 4 °C pendant 5 minutes, le surnageant étant éliminé et étiqueté avec précision.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
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