RIP-Seq – Cartographie du site de liaison du complexe protéine-ARN et interprétation de la régulation épigénétique

Les molécules à l'intérieur de la cellule communiquent entre elles afin d'exécuter les fonctions cellulaires normales. Les biomolécules peuvent former des complexes entre elles pour remplir un rôle spécifique. L'ARN et les protéines sont connus pour interagir, formant des complexes appelés ribonucléoprotéines ou RNP qui sont importants dans la modification et la régulation post-transcriptionnelles telles que la clivage de l'ARN, le transport, la localisation, l'édition de séquence et d'autres contrôles de traduction. L'analyse des sites de liaison de ces ribonucléoprotéines est utile pour comprendre la régulation transcriptionnelle et épigénétique qui se produit dans la cellule. Les informations obtenues à partir de ces études peuvent être utilisées pour déterminer des cibles de maladies et pour le développement de la découverte de nouvelles cibles médicamenteuses efficaces.

L'immunoprécipitation est utilisée pour isoler des antigènes protéiques par le biais de précipitation en utilisant la spécificité de liaison entre des antigènes protéiques particuliers et leurs anticorps correspondants. Les résultats peuvent ensuite être analysés dans une microarray. Cette technique peut également être utilisée pour précipiter des protéines en contact avec l'ARN (RIP-Chip). Une autre technique connexe est le Séquençage par immunoprécipitation d'ARN ou RIP-SeqAu lieu d'analyser la protéine qui se lie à l'ARN, l'ARN est la cible du RIP-Seq. Le composant ARN est séquencé à l'aide de techniques de séquençage à haut débit. Le RIP-Seq cartographie le site de liaison du complexe protéine-ARN et fournit la séquence à base unique de l'ARN lié à la protéine.

La RIP-Seq est couramment utilisée pour étudier les contrôles épigénétiques et transcriptomiques des ribonucléoprotéines. Elle est connue pour révéler l'interaction de ces deux biomolécules à l'échelle du génome. Elle a été inventée suite à la technologie RIP-Chip développée par Keene et al. en 1999. Son protocole relativement court et simple ne nécessite pas l'utilisation d'équipements de laboratoire complexes. Le succès de l'analyse RIP-Seq repose sur l'optimisation appropriée de l'étape d'immunoprécipitation, car elle détermine la rigueur du traitement afin de garantir que la composante ARN n'est pas endommagée et que les sites de liaison entre l'ARN et la protéine ne sont pas détruits.

Figure 1. Flux de travail du protocole de séquençage par immunoprécipitation de l'ARN. (Gagliardi, 2016)

Lors du séquençage par immunoprécipitation d'ARN, le complexe ARN-protéine cible est précipité avec un anticorps correspondant. Une digestion par RNase est ensuite réalisée pour éliminer les séquences d'ARN supplémentaires qui ne sont pas en contact avec la protéine. L'ARN résultant est ensuite extrait et rétro-transcrit en ADNc, qui est ensuite séquencé et cartographié de nouveau sur le génome. Ce processus peut être utilisé pour étudier des complexes ARN-protéine spécifiques avec une haute résolution sur la séquence d'ARN directement liée à la protéine.

Le séquençage RIP a été utilisé dans différentes études pour comprendre la cascade d'activités à l'intérieur de la cellule. Werfel, et al.. a utilisé cette technique pour étudier les activités des microARN (miARN). Ils ont pu démontrer que l'activité des miARN chez les mammifères est influencée par une liaison préférentielle à une région 3' particulière, ouvrant ainsi la voie à la régulation entre les cibles potentielles. Bersani, et al.. a utilisé la technologie pour étudier le comportement de Wig-1, une protéine liant l'ARN qui se lie et régule l'expression de plusieurs ARNm. Leur étude suggère de nouveaux sites de liaison pour Wig-1 et une corrélation potentielle entre leurs résultats et la réponse au stress ainsi que la suppression des tumeurs.

La technologie RIP-seq a prouvé son utilité dans différentes études liées au contrôle épigénétique et transcriptionnel. Elle offre une vue sur les mécanismes de liaison particuliers des protéines liant l'ARN, qui peuvent être utilisés pour prédire les ARNm cibles. Elle peut également être utilisée pour étudier le développement des maladies, y compris le cancer, et concevoir de nouvelles thérapies.

Références :

1. Bersani, C., et al.Identification à l'échelle du génome des cibles d'ARNm de Wig-1 par analyse RIP-Seq. Oncotarget, 2015, 7(2).
2. Nicholson, C.O., Friedersdorf, M., Keene, J.D. Quantification des sites de liaison à l'ARN à l'échelle du transcriptome en utilisant DO-RIP-seq. Journal RNA, 2016, 23(1).
3. Wessels, H., Hirsekorn, A., Ohler, U. et al, N. Identification des cibles des RBP avec le RIP-seq. Méthodes en biologie moléculaire, 2016.
4. Gagliardi M., Matarazzo M.R. RIP : Immunoprécipitation de l'ARN. Dans : Lanzuolo C., Bodega B. (éds) Protéines du groupe Polycomb. Méthodes en biologie moléculaire, 2016.