FAQ sur le séquençage microbien

Questions générales

Qu'est-ce que le séquençage de la diversité des communautés microbiennes ?

L'identification des populations microbiennes implique le séquençage à haut débit des gènes d'ARNr 16S bactériens et des gènes d'ARNr 18S fongiques, ainsi que des séquences ITS (Espace Transcrit Interne). L'objectif est de caractériser les populations microbiennes en séquençant des régions génétiques spécifiques. Le terme "gène d'ARNr 16S" (gène d'ARNr 18S) fait référence aux séquences d'ADN correspondantes codant pour l'ARNr ribosomal 16S (18S) dans les génomes bactériens (fongiques). Ces gènes comprennent neuf régions hypervariables (V1-V9) et dix régions conservées. L'ITS, composé de ITS1 et ITS2, est situé entre les régions 18S et 5.8S et les régions 5.8S et 28S, respectivement, dans la séquence du gène d'ARNr ribosomal eucaryote. Le séquençage de ces régions spécifiques fournit des informations précieuses sur les espèces microbiennes et leur abondance.

Dans les résultats analytiques fournis, l'absence d'une espèce particulière soulève la question de savoir s'il est possible de conclure que l'espèce est réellement absente de l'échantillon ?

En théorie, l'absence d'informations sur une espèce particulière dans l'échantillon analysé implique sa non-existence dans cet échantillon. Cependant, deux scénarios pratiques pourraient affecter cette détermination. Premièrement, les amorces PCR utilisées peuvent présenter un biais, ce qui signifie que l'espèce pourrait être présente dans l'échantillon (bien qu'en faible abondance), mais que l'amplification PCR échoue, entraînant sa non-détection lors du séquençage ultérieur. Deuxièmement, l'absence d'informations pertinentes sur cette espèce dans la base de données peut entraîner l'incapacité d'aligner les séquences obtenues avec des informations sur l'espèce lors de l'analyse, même si l'espèce est présente dans les données séquencées.

Concernant la conception expérimentale du projet sur la diversité microbienne, pourquoi est-il essentiel d'incorporer des réplicats biologiques ?

L'inclusion de réplicats biologiques est une considération critique dans la conception de projets de diversité, en particulier ceux axés sur l'analyse différentielle. Dans les études impliquant une analyse différentielle, des tests paramétriques et non paramétriques, tels que les tests t et les tests de somme de rangs, sont couramment utilisés. Quelle que soit la méthode de test, les calculs impliquant des paramètres tels que la variance et la moyenne sont essentiels, et des valeurs numériques significatives ne peuvent être dérivées que lorsque des réplicats biologiques sont présents. Ainsi, du point de vue des principes d'analyse des données, les réplicats biologiques sont indispensables. De plus, les facteurs influençant les échantillons environnementaux dans la recherche sur la diversité sont intrinsèquement complexes. Un échantillon unique représentant un groupe est insuffisant et produit des résultats peu fiables. L'incorporation de réplicats biologiques ajoute une signification statistique à l'étude, renforçant sa fiabilité face aux influences multiples sur les échantillons environnementaux dans la recherche sur la diversité.

Quelles sont les différences entre les réplicats biologiques, les réplicats techniques et les échantillons groupés ?

Au-delà des études sur la diversité, dans les conceptions expérimentales conventionnelles, les distinctions entre les réplicats biologiques, les réplicats techniques et les échantillons groupés ont toujours été des considérations essentielles influençant la conception expérimentale. Examinons les définitions et l'importance de ces trois concepts.
Les répliques biologiques, en termes simples, désignent différents échantillons soumis au même traitement. L'inclusion de répliques biologiques vise à valider des conclusions générales en résumant les résultats d'un ensemble d'échantillons et en généralisant ces caractéristiques à l'ensemble de la catégorie d'échantillons.
Les réplicats techniques sont des répétitions de procédures techniques introduites lors des expériences pour tenir compte des erreurs ou des écarts potentiels. Par exemple, dans le séquençage, effectuer trois courses de séquençage sur le même échantillon de sol constitue un ensemble de réplicats techniques, démontrant la stabilité de la préparation de la bibliothèque et des résultats de séquençage dans une plage raisonnable.
Les échantillons groupés, comme leur nom l'indique, impliquent le mélange approfondi de plusieurs échantillons (souvent en proportions égales). Le regroupement d'échantillons sert à homogénéiser les différences entre les échantillons individuels, offrant un mélange plus représentatif qui encapsule mieux les caractéristiques de cette catégorie d'échantillons.
Ces trois approches de conception d'échantillons peuvent être utilisées en combinaison ou individuellement, en fonction des objectifs de recherche. Pour des questions spécifiques, n'hésitez pas à consulter notre équipe technique.

Directives communes pour la collecte d'échantillons expérimentaux.

Collecte d'échantillons de sol : Choisissez une zone de sol représentative et utilisez des outils stériles pour prélever une quantité spécifiée de sol à une profondeur de 5 à 10 cm. Éliminez toutes les impuretés, portionnez, étiquetez et scellez chaque sac d'échantillon contenant environ 5 à 10 g de sol. Conservez immédiatement les échantillons scellés à basse température.
Collecte d'échantillons fécaux : Utilisez des dispositifs de collecte fécale stériles ou d'autres contenants stérilisés pour recueillir des échantillons fécaux. Portionnez, étiquetez et conservez rapidement les échantillons à basse température (alternativement, étiquetez et conservez d'abord avant de portionner). Pour chaque échantillon, répartissez dans plusieurs tubes de centrifugeuse stériles, chacun contenant environ 0,2 g. Dans les cas où les fèces de souris individuelles sont insuffisantes (<0,2 g), des répliques biologiques peuvent être combinées. Évitez une exposition prolongée des échantillons fécaux à l'air pour prévenir la contamination et la dégradation. Pour les échantillons précieux ou difficiles à collecter, il est conseillé de créer des sauvegardes.

Mes résultats d'extraction d'acides nucléiques et de contrôle de qualité de mon échantillon environnemental ne sont pas satisfaisants. Puis-je quand même procéder au séquençage d'amplicons ?

Le séquençage par amplicon implique l'amplification par PCR de régions génomiques spécifiques pour un groupe particulier de micro-organismes. Le contrôle de la qualité de l'ADN n'est qu'une partie de l'évaluation de la qualité, et la décision de procéder au séquençage dépend du rapport de contrôle de qualité de l'amplification PCR. Dans les cas où l'extraction d'acides nucléiques produit un matériel limité, mais qu'une qualité et une quantité suffisantes de produits PCR peuvent être obtenues, le séquençage peut tout de même être réalisé.

Mon étude se concentre sur les bactéries endophytes, et j'ai l'intention de réaliser des projets d'amplicon/métagénomique. Quels sont les risques et quelles recommandations avez-vous pour les premières étapes de l'expérience ?

Tout d'abord, envisagez si des bactéries endophytes peuvent être isolées. Si l'isolement n'est pas réalisable, il existe un risque inhérent de contamination des tissus végétaux et animaux dans l'échantillon. Le risque potentiel dans le séquençage d'amplicons réside dans l'amplification des chloroplastes végétaux et des séquences mitochondriales animales. Le séquençage métagénomique peut entraîner une contamination substantielle de l'hôte, en particulier si l'hôte ne dispose pas d'un génome de référence. Dans de tels cas, le séquençage d'amplicons devrait être considéré comme une option préférable.

Recommandations pré-expérimentales :

Pour le séquençage d'amplicons, il est conseillé de réaliser une revue de la littérature afin de sélectionner des amorces qui excluent efficacement les séquences chloroplastiques, évaluant ainsi la faisabilité de l'étude.
Pour le séquençage métagénomique, un test préliminaire sur un sous-ensemble d'échantillons est recommandé. Cela permet de comprendre la proportion des composants hôtes (plantes et animaux) et microbiens au sein des échantillons. Il est essentiel d'évaluer si les données microbiologiques sont suffisantes pour les analyses ultérieures. Si les données microbiologiques sont insuffisantes, un séquençage supplémentaire peut être envisagé pour obtenir un ensemble de données analysable.