Séquençage CRISPR : Introduction, Flux de travail et Applications

Le système CRISPR-Cas9

Le système de ciblage génétique CRISPR-Cas9, qui se compose de deux composants : un ARN guide personnalisé (sgRNA, qui contient une séquence crRNA spécifique à la cible et tracrRNA) et une endonucléase associée à CRISPR non spécifique (Cas9), est un nouvel outil d'ingénierie génomique qui permet aux scientifiques de modifier des parties du génome en supprimant, ajoutant ou changeant une section de la séquence d'ADN dans un organisme. C'est actuellement la méthode de manipulation génétique la plus simplifiée, flexible, précise et efficace, avec de nombreuses applications en médecine et dans l'amélioration des semences de cultures. CRISPR-Cas9 a également révolutionné la génération de mutations ciblées en permettant un édition du génome à haut débit.

Introduction au séquençage CRISPR

Dans le processus d'expérimentation CRISPR, la validation des modifications est particulièrement cruciale. En raison de la possibilité de mutations hors cible, plutôt que de modifications dans le gène cible, le séquençage de nouvelle génération (NGS) est une technique simple et à haut débit pour vérifier les mutations préférées. Pour le milieu académique, les cliniques et l'industrie, le séquençage d'amplicons CRISPR est devenu une méthode de validation standardisée. L'idée du criblage CRISPR à haut débit est axée sur le séquençage d'amplicons ciblés, qui est réalisé à l'aide d'expériences PCR avec des amorces encadrant la zone ciblée. La technique la plus délicate pour vérifier les mutations est le séquençage d'amplicons ciblés, qui a des fréquences de détection aussi basses que 0,01 %.

Figure 1. Stratégies d'enrichissement basées sur CRISPR pour le séquençage ciblé. (Schultzhaus, 2020)

Séquençage CRISPR peut fournir des données directes et complètes sur la nature et la variété des mutations, telles que la confirmation des allèles knockout/knockin, l'évaluation de l'efficacité de coupe des sgRNA, l'identification des homozygotes et hétérozygotes, le calcul des fréquences de mutation, etc.

Flux de travail de séquençage CRISPR

L'isolement de l'ADN, les expériences de PCR, le séquençage profond et l'analyse des données font tous partie du flux de travail de séquençage des mutations CRISPR. Les chercheurs peuvent utiliser le séquençage des mutations CRISPR pour vérifier la bibliothèque de guides, évaluer les cibles CRISPR/Cas9 et l'efficacité des mutations, et trouver les sites cibles les plus prometteurs.

Étape 1: Conception - Sélectionnez une enzyme Cas et créez un ARN guide.

Étape 2: Livraison - Il est recommandé de combiner l'enzyme Cas et l'ARN guide pour former un ribonucléoprotéine afin de livrer l'enzyme Cas et l'ARN guide aux cellules (RNP). L'électroporation ou la lipofection peuvent ensuite être utilisées pour livrer le RNP aux cellules. Pour améliorer l'efficacité de la transfection, des activateurs d'électroporation séparés peuvent être utilisés pour Cas9 et Cas12a.

Étape 3Réparation - Les RNP contenant Cas9 ou Cas12a coupent l'ADN génomique, provoquant une cassure double brin (DSB). La jonction des extrémités non homologues (NHEJ) et la réparation dirigée par homologie (HDR) sont des processus naturels dans les cellules. La voie NHEJ peut être utilisée pour créer des knockouts afin d'étudier la fonction des gènes. La HDR nécessite non seulement des RNP pour créer la DSB, mais aussi un modèle pour diriger la réparation, et peut être utilisée pour introduire des mutations spécifiques.

Étape 4Analyse - En fonction de vos besoins en recherche, vous pouvez utiliser une variété de méthodes pour détecter des mutations. Les méthodologies basées sur les gels peuvent être utilisées pour déterminer la présence d'une transition dans une séquence génomique de manière non spécifique. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est fortement recommandé pour établir le succès de l'édition ciblée et pour enquêter sur les effets hors cible.

Applications

La technologie CRISPR-Cas9 a transformé la capacité à modifier l'ADN et à moduler les niveaux d'expression des gènes d'intérêt, fournissant des outils efficaces pour accélérer l'ingénierie précise d'une variété d'organismes. De plus, le système CRISPR-Cas peut être utilisé pour créer des antimicrobiens de "précision" qui ciblent les agents pathogènes bactériens en fonction de leur séquence d'ADN. En ciblant sélectivement les gènes associés à la résistance aux antibiotiques, à la formation de biofilms et à la virulence, ce potentiel permettra de tuer les microbes résistants aux médicaments.

Références :

1. Schultzhaus Z, Wang Z, Stenger D. Stratégies d'enrichissement basées sur CRISPR pour le séquençage ciblé. Avancées en biotechnologie2020 Nov 28:107672.
2. de la Fuente-Núñez C, Lu TK. Technologie CRISPR-Cas9 : applications dans l'ingénierie génomique, développement d'antimicrobiens spécifiques à des séquences et perspectives d'avenir. Biologie intégrative1er février 2017 ; 9(2).
3. Selle K, Barrangou R. Technologies basées sur CRISPR et l'avenir de la science alimentaire. Journal des sciences alimentaires. Novembre 2015 ; 80(11).
4. Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, et al.Une classification évolutive mise à jour des systèmes CRISPR–Cas. Nature Reviews Microbiologie. Nov 2015 ; 13(11).