Une exploration complète des méthodes d'analyse des sites d'intégration

Thérapie génique et cellulaire

En 1990, W.F. Anderson, un scientifique médical américain pionnier, a réalisé un exploit révolutionnaire dans le domaine de la thérapie génique. Son travail transformateur a impliqué l'application de la thérapie génique à une fille de 4 ans souffrant d'une déficience en adénosine désaminase, marquant un moment historique en tant que premier triomphe mondial en thérapie génique et un jalon essentiel dans l'histoire médicale. Au cours des décennies suivantes de développement incessant, la thérapie génique est devenue un phare d'espoir, offrant un changement de paradigme dans l'approche du traitement des maladies en s'attaquant à leurs racines génétiques.

Catégoriquement, la thérapie génique se déroule en deux modes de traitement distincts. La thérapie in vivo implique l'injection directe de vecteurs portant les gènes requis dans la circulation sanguine ou des organes cibles spécifiques. Cette méthode trouve son application dans les domaines des maladies génétiques monogéniques, de l'hémophilie et des affections ophtalmiques. D'autre part, la thérapie in vitro, reconnue comme thérapie cellulaire, consiste en l'extraction des cellules d'un patient, la modification génétique en dehors du corps, puis la réintroduction dans le système du patient. Une manifestation notable de la thérapie in vitro est la thérapie par cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR-T), une approche de précision à la pointe de la technologie qui annonce une nouvelle ère dans le traitement des tumeurs.

La trajectoire du progrès est évidente dans l'approbation de plus de 20 médicaments de thérapie génique et de 8 produits CAR-T par les agences nationales de réglementation des médicaments. Armés de biotechnologies sophistiquées et de voies thérapeutiques prometteuses, les médicaments de thérapie génique et cellulaire sont prêts à jouer un rôle clé dans le paysage futur de la prévention et du traitement des maladies.

Service d'analyse des sites d'intégration lentivirale de CD Genomics utilise la puissance de la plateforme Illumina pour la détection des sites d'intégration et a développé une approche à faible coût et à haut débit en utilisant le séquençage par enrichissement ciblé ou la méthode LM-PCR. Nous sommes ravis d'utiliser notre vaste expérience et notre plateforme avancée pour offrir le meilleur service et les produits les plus qualifiés afin de satisfaire chaque demande de nos clients.

Flux de travail d'analyse du site d'intégration – CD Genomics

Intégration lentivirale dans la thérapie génique et cellulaire

Dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, le mode et l'efficacité de la délivrance de gènes jouent un rôle crucial dans la détermination de l'impact thérapeutique du médicament. Par conséquent, le choix d'un vecteur approprié revêt une importance primordiale. Les systèmes lentiviraux ont été largement utilisés dans diverses applications thérapeutiques en raison de leur large spectre d'infectivité, de leur capacité à infecter à la fois des cellules en division et des cellules non divisantes, ainsi que de l'expression soutenue et stable de gènes exogènes à long terme.

Intégration virale se présente comme un aspect crucial du cycle de vie standard des lentivirus. Le processus commence par la reconnaissance par le virus d'un récepteur à la surface de la cellule hôte, facilitant le transfert d'ARN et de protéines dans la cellule. Par la suite, l'ARN subit une transcription inverse en ADN, et l'intégrase reconnaît la Long Terminal Repeat (LTR) portée par l'ADN viral. Elle clive ensuite le génome de l'hôte de manière aléatoire ou semi-aléatoire, entraînant des extrémités collantes qui fusionnent parfaitement avec l'ADN viral, complétant ainsi l'insertion du gène exogène. L'intégration virale émerge comme une étape indispensable pour l'expression des gènes exogènes et la réalisation des effets thérapeutiques de la thérapie génique.

Méthodes d'analyse des sites d'intégration

• Technologie PCR

À l'origine, l'analyse des intégrations virales impliquait le Southern blot et des bibliothèques génomiques pour caractériser les sites d'intégration. Au fil du temps, la PCR a remplacé le Southern blot en tant que méthode analytique principale pour les intégrations virales en raison de sa simplicité opérationnelle et de la précision des résultats. Dans le domaine de la technologie PCR, trois catégories principales ont émergé pour l'analyse des intégrations virales : la PCR inverse (R-PCR), PCR médiée par ligation (LM-PCR)et la PCR médiée par amplification linéaire (LAM-PCR).

Dans la PCR inverse, l'ADN est clivé enzymatiquement puis ligaturé en une boucle. Des amorces inverses sont conçues pour l'amplification, permettant la récupération de séquences inconnues de chaque côté du site d'intégration viral. Cependant, l'efficacité limitée de la formation de boucles par la ligase contraint l'utilité de la PCR inverse.

LM-PCR implique de relier les deux extrémités de l'ADN après clivage et interruption, avec des amorces conçues sur la base de séquences fixes de l'ADN viral et des jonctions. Cette approche déverrouille les informations de position du site d'intégration viral. LM-PCR est connue pour sa simplicité et sa facilité d'utilisation, restant en usage depuis son inception jusqu'à nos jours.

LAM-PCR représente une technique plus avancée où l'ADN est d'abord amplifié de manière linéaire, et le produit simple brin obtenu de cette amplification est ensuite amplifié par LM-PCR pour obtenir le produit spécifique de l'amplification simple brin. L'introduction de l'amplification linéaire améliore la sensibilité et la spécificité de LAM-PCR, dépassant celle de la PCR inverse et de la LM-PCR, ce qui en fait une méthode largement adoptée dans la recherche actuelle.

Schéma de LAM-PCR pour amplifier les séquences de fusion génomique du vecteur rétroviral 5'-LTR. (Schmidt et al., 2007)

• Séquençage de nouvelle génération (NGS)

la technologie de séquençage de nouvelle génération. séquençage de nouvelle génération (NGS) comme la technologie prédominante pour l'analyse intégrative des sites. Le séquençage de nouvelle génération (NGS), grâce à ses données de séquençage abondantes, élargit considérablement le spectre des sites d'intégration. Notamment, il excelle dans la détection des clones d'intégration à faible fréquence, fournissant des informations précieuses pour le développement de médicaments.

Le processus de construction de bibliothèques de séquençage à haut débit est plus complexe par rapport à la PCR traditionnelle. Les méthodes de construction de bibliothèques couramment utilisées incluent la LM-PCR, la LAM-PCR et la LAM-PCR sans digestion par enzyme de restriction. Bien que la construction de bibliothèques par LAM-PCR implique les complexités et les coûts élevés associés aux amorces marquées par la biotine et aux billes magnétiques marquées par la streptavidine dans l'amplification linéaire, la LM-PCR se présente comme une alternative pragmatique. La LM-PCR facilite l'enrichissement des séquences de sites d'insertion grâce à un processus de PCR en deux étapes, permettant la construction de bibliothèques en 6 à 7 heures. Cette approche rationalisée accélère le cycle de construction de bibliothèques, en faisant une méthode optimale pour détecter les sites d'insertion lentiviraux.

Les lentivirus possèdent de longues séquences terminales (5'LTR et 3'LTR) à chaque extrémité, et la LM-PCR peut amplifier les deux LTR pour former des bibliothèques. Cependant, dans les méthodes de construction de bibliothèques conventionnelles, la moitié des lectures de données en aval deviennent des informations redondantes concernant l'intégration des LTR avec les séquences provirales. Ainsi, l'adaptation de la LM-PCR se distingue comme un choix efficace et idéal pour la détection des sites d'insertion des lentivirus.

Référence:

1. Schmidt, M., Schwarzwaelder, K., Bartholomae, C. et al. Analyse des sites d'insertion à haute résolution par PCR médiée par amplification linéaire (LAM-PCR). Méthodes Nat 4, 1051–1057 (2007).