Un guide sur le séquençage de l'exome entier du cancer

Séquençage de l'exome entier (WES) est devenu une force transformative, permettant l'analyse complète des régions codantes des gènes liés aux maladies et à l'évolution des populations. Lorsqu'il est associé aux vastes données d'exome disponibles dans les bases de données publiques, le WES devient un outil puissant pour déchiffrer les relations complexes entre les variants génétiques, les maladies et les mécanismes sous-jacents. Bien que ses applications soient diverses, l'application du WES dans la recherche sur le cancer brille le plus en raison de sa complexité et des opportunités sans précédent qu'il offre pour s'attaquer à l'un des ennemis les plus redoutables de l'humanité.

De tissu à données : étapes du séquençage de l'exome complet. (Bartha et al., 2020)

Exigences d'échantillons et extraction d'ADN : Fondements d'une analyse précise

Conduite Séquençage de l'exome entier du cancer (CWES) nécessite une sélection minutieuse des échantillons et une extraction d'ADN pour garantir la fidélité et la pertinence des résultats. Les tissus tumoraux, les échantillons fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE), ainsi que le sang périphérique sont les types d'échantillons couramment utilisés. Cependant, un aspect essentiel du CWES est l'appariement des échantillons tumoraux avec des échantillons normaux correspondants. Cet appariement permet non seulement de réduire l'impact du contexte génétique, mais aussi d'identifier les mutations somatiques uniques à la tumeur.

Le processus d'extraction de l'ADN est un art délicat visant à préserver l'intégrité de l'ADN tout en éliminant les contaminants. Il implique une série d'étapes telles que la lyse cellulaire, le traitement enzymatique, la séparation des acides nucléiques et la purification. Notamment, les défis posés par les échantillons FFPE nécessitent une attention particulière. Le réticulation induite par le formaldéhyde, la formation d'adduits d'ADN et les modifications conduisant à des faux positifs soulignent la nécessité d'une approche stratégique dans le traitement de tels échantillons.

Maîtriser la construction de bibliothèques : nuances techniques

La construction de bibliothèques dans le CWES est une entreprise multidimensionnelle où la précision est primordiale. Plusieurs aspects techniques doivent être soigneusement abordés pour garantir des résultats de séquençage précis et fiables.

• Optimisation de l'efficacité de la transformation des fragments
  Le succès de la construction de bibliothèques dépend de l'atteinte d'une haute efficacité de transformation des fragments, c'est-à-dire de la conversion d'un maximum de fragments d'ADN de départ en fragments de bibliothèque mesurables. Un facteur clé de succès est la complexité de la bibliothèque, qui se traduit par une couverture de données de séquençage plus riche des régions cibles. Pour y parvenir, il est nécessaire de prendre en compte avec soin la quantité, la qualité de l'ADN de départ et l'efficacité de conversion des fragments. Des tests et évaluations rigoureux sont indispensables pour réaliser une efficacité optimale de transformation des fragments.
• Dominer le bruit de fond
  Dans la danse complexe de Séquençage de nouvelle génération (NGS)Des erreurs s'invitent, et le bruit de fond brouille le signal. Le bruit de fond provient de diverses sources, y compris les erreurs de PCR, les inexactitudes de séquençage et les régions génomiques complexes. Pour y remédier, il faut de l'ingéniosité : des étiquettes moléculaires uniques attachées aux fragments d'ADN lors de la construction de la bibliothèque agissent comme des sentinelles, aidant à discerner les vraies mutations des signaux erronés. Cette stratégie astucieuse réduit efficacement le bruit de fond, augmentant la précision de la détection des mutations.
• Défi de la contamination
  Le spectre de la contamination croisée des échantillons hante la construction de bibliothèques, posant une grave menace à la véracité des résultats. Des étiquettes mal placées ou des croisements de données lors de l'analyse peuvent fausser les conclusions. Pour contrecarrer cela, l'utilisation de l'indexation à double extrémité lors de la construction de la bibliothèque devient impérative. Particulièrement pertinent sur des plateformes comme Illumina, où des sauts d'index peuvent se produire, cette approche protège contre la contamination croisée des échantillons et préserve l'intégrité des résultats.
• Neutralisation du biais d'amplification
  Les régions génomiques doivent être également représentées dans l'ensemble de données de séquençage final pour éviter l'amplification préférentielle et les biais d'interprétation. Atteindre cet équilibre nécessite la sélection d'une enzyme à haute fidélité et le calibrage minutieux des cycles d'amplification PCR. En minimisant le biais d'amplification, une représentation plus précise des variants génétiques émerge.

Analyse des données : Déchiffrer la tapisserie génétique

La phase d'analyse des données est celle où se révèle la véritable puissance de CWES est exploité. Cela implique de déchiffrer les altérations génomiques complexes qui entraînent la progression du cancer et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles.

• Priorisation des variantes
  Le tri à travers la vaste gamme de variants nécessite une priorisation stratégique. Les variants sont classés en fonction de leur impact fonctionnel, de leur fréquence dans les bases de données et de leur pertinence pour la biologie du cancer. Les variants pathogènes et probablement pathogènes ont la priorité en tant que mutations potentielles conductrices.
• Annotation fonctionnelle et analyse des voies métaboliques
  Les outils d'annotation fonctionnelle révèlent les conséquences potentielles des variants identifiés. Prédire leur impact sur la structure et la fonction des protéines aide à évaluer leur rôle dans la carcinogenèse. L'analyse des voies de signalisation contextualise ces variants, mettant en évidence les voies de signalisation altérées cruciales pour le développement du cancer.
• Intégration avec les données cliniques
  Marier les informations génomiques avec les données cliniques crée un profil patient complet. L'historique du patient, la réponse au traitement et les données sur les résultats guident l'identification des mutations exploitables et des stratégies de traitement potentielles. Cette intégration pose les bases de l'oncologie de précision, adaptant les thérapies au paysage génétique unique d'un patient.

Référence :

1. Bartha, Áron et Balázs Győrffy. "Algorithmes d'analyse des données de séquençage de l'exome entier dans le diagnostic du cancer." (2020).