Profilage des ribosomes : Définition, Applications, Principes et Flux de travail

Qu'est-ce que le profilage des ribosomes ?

Profilage des ribosomes, également connu sous le nom de Ribo-seq, est une technique de séquençage à haut débit récemment développée, basée sur le séquençage de fragments d'ARNm protégés par les ribosomes. Le profilage des ribosomes permet une mesure détaillée et précise de la traduction cellulaire, même in vivoLe Ribo-seq permet de surveiller les processus de traduction cellulaire, de déterminer les protéines activement traduites dans une cellule et de prédire l'abondance des protéines, aidant ainsi à définir le protéome d'organismes complexes. De plus, le Ribo-seq peut fournir des informations sur le mécanisme de régulation de la traduction. Par exemple, il peut être utilisé pour détecter des pauses de traduction régulatrices et des ORFs en amont traduits, et surveiller les processus de traduction médiés par des sous-ensembles de ribosomes. Le profilage des ribosomes est la première méthode disponible pour l'annotation des cadres de lecture ouverts (ORFs) traduits et a permis la découverte de nombreux produits protéiques nouveaux ou alternatifs.

Applications du profilage des ribosomes :

• Identifier des séquences traduites au sein du transcriptome complexe.
• Cartographier les sites d'initiation de la traduction
• Mesurer l'expression génique différentielle au niveau de la traduction de l'ARNm.
• Identifier des gènes codant des protéines nouveaux et le ralentissement des ribosomes.
• Fournir des données pour des modèles quantitatifs de traduction.
• Fournir des informations sur le mécanisme de la synthèse des protéines, le contrôle de la traduction et le processus d'infection virale.

Principes du profilage des ribosomes

Le profilage des ribosomes tire parti du fait que les ribosomes engagés dans la traduction peuvent protéger environ 30 nucléotides d'un fragment d'ARNm contre la digestion par l'ARNase. Cette technique exploite d'abord la méthode moléculaire classique du marquage des ribosomes. Dans cette méthode, in vitro Les ARNm traduits sont traités avec des nucléases pour détruire les régions non protégées. Les ARNm protégés par le ribosome peuvent être cartographiés par rapport à l'ARNm original pour déterminer l'emplacement exact du ribosome en train de traduire. Le profilage des ribosomes étend la méthode de l'empreinte des ribosomes en cartographiant et en mesurant l'ensemble des empreintes de ribosomes pour quantifier la synthèse de nouvelles protéines et annoter les régions codantes à l'échelle mondiale. Les avancées dans la technologie de séquençage permettent une analyse profonde et précise de tous les ribosomes en traduction par mRNA-seq.

Flux de travail du profilage des ribosomes

Le profilage des ribosomes basé sur le séquençage de nouvelle génération (NGS) nécessite la préparation d'un échantillon physiologique, in vivo capture des ribosomes traduisants et des ARNm, lyse, digestion par des nucléases (typiquement RNase I ou nucléase micrococcale) pour obtenir des fragments protégés par les ribosomes, isolation des ribosomes et ensuite, empreintes de ribosomes, qui sont converties en une bibliothèque spécifique à un brin et soumises à un séquençage de nouvelle génération (NGS). Les séquences des fragments sont ensuite mappées contre le génome de référence approprié. Le profilage des ribosomes fournit des informations à l'échelle du génome sur la synthèse des protéines (GWIPS) in vivo.

En comparant les taux de synthèse des protéines et l'abondance des ARNm, l'efficacité de la traduction pour chaque ARNm peut être déterminée.

Figure 1. Flux de travail pour le profilage des ribosomes (Brar et Weissman 2015).

Références :

1. Brar G A, Weissman J S. Le profilage des ribosomes révèle le quoi, le quand, le où et le comment de la synthèse des protéines. Revue de la nature : biologie cellulaire moléculaire, 2015, 16(11) : 651-664.
2. Ingolia N T. Profilage des ribosomes : nouvelles perspectives sur la traduction, des codons uniques à l'échelle du génome. Nature Reviews Génétique, 2014, 15(3) : 205-213.