Protocole de séquençage d'ARN direct par nanopore

Réaction de poly(A) ajoutée

1. 17 μl d'ARN dans un tube PCR est incubé à 65 °C pendant 2 minutes et immédiatement placé sur de la glace pour éviter la formation de structures secondaires.
Ajoutez 3,5 μl de tampon de réaction 10× E. coli Poly(A) Polymerase dans 17 μl d'ARN dans un tube PCR, puis amenez à température ambiante.
Ajoutez 4,5 μl d'ATP dans le tube PCR, suivi de 4 μl de polymérase poly(A) d'E. coli et de 1 μl d'inhibiteur de RNase dans le tube PCR.
4. Mélangez doucement avec une pipette P200 et incubez la réaction à 37 °C pendant 10 minutes.
5. Arrêtez la réaction en passant directement à l'étape de purification des billes. Mélangez bien les billes Agencourt RNAClean XP afin que le réactif apparaisse homogène et de couleur uniforme. Ajoutez 60 μl de billes Agencourt RNAClean XP homogènes dans le tube PCR et mélangez bien à l'aide d'une pipette P200. Incubez pendant 5 minutes.
6. Place le tube PCR sur le support magnétique pendant 2 minutes.
7. Retirez délicatement le surnageant.
8. Lavez l'ARN deux fois avec de l'éthanol à 80 % en ajoutant 180 μl d'éthanol à 80 % et incubez pendant 1 minute. Ensuite, retirez l'éthanol sans perturber le culot.
9. Laissez sécher à l'air à température ambiante pendant 2 minutes (jusqu'à ce que ce soit sec mais pas craqué).
10. Éluez avec 12 μl d'eau sans nucléase et agitez le tube. Incubez pendant 2 minutes à température ambiante.
11. Place le tube PCR sur le support magnétique pendant 2 minutes.
12. Pipetez 11 μl d'ARN poly(A) avec queue dans un nouveau tube PCR et placez le tube sur de la glace.
13. Mesurez la concentration finale d'ARN (facultatif).

dRNA-seq

1. Ligation d'adaptateur : Mélangez 3,0 μl de tampon de réaction de ligation rapide NEBNext dans l'ARN à queue poly(A), suivi de 1,0 μl d'adaptateur RT (RTA) et de 1,5 μl de ligase T4 ADN. Mélangez par pipetage et centrifugez. Incubez la réaction pendant 10 minutes à température ambiante.
2. Transcription inverse : Préparez le mélange maître de transcription inverse en mélangeant 9,0 μl d'eau sans nucléase, 2,0 μl de dNTPs à 10 mM, 8,0 μl de tampon de première chaîne 5x, 4,0 μl de DTT à 0,1 M. Ajoutez le mélange maître au tube PCR contenant l'ARN ligaturé avec l'adaptateur RT. Mélangez avec une pipette de 200 μl. Ajoutez 2 μl de transcriptase inverse SuperScript IV à la réaction. Placez le tube dans un thermocycleur et incubez à 50 °C pendant 10 min, puis à 70 °C pendant 10 min, et amenez la réaction à 4 °C.
3. Nettoyage de l'ARN avec de l'éthanol à 80 % : Vortexez les billes Agencourt RNAClean XP pour les resuspendre. Ajoutez 72 μl de billes Agencourt RNAClean XP resuspendues à la réaction de transcription inverse et mélangez par pipetage. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Centrifugez l'échantillon et récupérez le culot sur un support magnétique pendant 3 minutes. Gardez le tube sur l'aimant et éliminez le surnageant par pipetage. Lavez l'ARN deux fois avec 180 μl d'éthanol à 80 %. Retirez l'éthanol à 80 % à l'aide d'une pipette et jetez-le. Centrifugez et replacez le tube sur l'aimant. Pipetez tout résidu d'éthanol à 70 %. Laissez sécher à l'air libre à température ambiante pendant 1 minute. Retirez le tube du support magnétique et resuspendez le culot dans 20 μl d'eau sans nucléase et tapotez le tube. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Replacez le tube sur l'aimant pendant 1 minute et pipetez 20 μl d'éluate dans un nouveau tube PCR de 0,2 ml.
4. Ligation de protéines motrices : Ajoutez 8,0 μl de tampon de réaction de ligation rapide NEBNext dans les 20 μl d'ARN reverse-transcrit éluté. Ajoutez ensuite 4,5 μl - 6,0 μl d'adaptateur ARN (RMX), suivi de 3,0 μl d'eau sans nucléase et 3,0 μl de ligase T4 ADN. Mélangez avec une pipette de 200 μl. Incubez la réaction pendant 10 minutes à température ambiante.
5. Nettoyage de l'ARN avec le tampon de lavage (WSB) : Vortexez les billes Agencourt RNAClean XP pour les resuspendre. Ajoutez 40 μl de billes Agencourt RNAClean XP resuspendues au tube de réaction et mélangez par pipetage. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Centrifugez l'échantillon et récupérez le culot sur un support magnétique pendant 3 minutes. Gardez le tube sur l'aimant et éliminez le surnageant par pipetage. Ajoutez 150 μl de WSB aux billes. Fermez le couvercle du tube et agitez doucement le tube. Centrifugez à nouveau et replacez le tube sur l'aimant. Éliminez le WSB à l'aide d'une pipette et jetez-le. Répétez l'ajout et l'élimination du WSB. Pipetez tout résidu de WSB. Retirez le tube du support magnétique et resuspendez le culot dans 20 μl de tampon d'élution en agitant doucement le tube. Incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Replacez le tube sur l'aimant pendant 2 minutes ou jusqu'à ce que l'éluate soit clair. Pipetez 20 μl d'éluate dans un nouveau tube PCR de 0,2 ml. Ajoutez 17,5 μl d'eau sans nucléase à la bibliothèque d'ARN préparée et mélangez avec une pipette de 200 μl. Le volume total est de 37,5 μl.
6. Amorçage et chargement de la cellule de flux SpotON : Mélangez soigneusement le tampon de course d'ARN (RRB), le tampon de rinçage (FB) et les tubes de liaison de rinçage (FLT) par vortexage, puis centrifugez et conservez toutes les solutions à température ambiante. Pour préparer le mélange d'amorçage de la cellule de flux, ajoutez 30 μl de FLT directement au tube de FB et vortexez. Faites glisser le couvercle du port d'amorçage dans le sens des aiguilles d'une montre pour ouvrir le port d'amorçage. Réglez une pipette P1000 sur 200 μl et insérez l'embout dans le port d'amorçage. Tournez la molette jusqu'à ce que vous puissiez voir un petit volume (20 μl de couleur jaune) de tampon entrer dans l'embout de la pipette. Chargez 800 μl du mélange d'amorçage dans la cellule de flux via le port d'amorçage, en évitant l'introduction de bulles d'air. Attendez 5 minutes. Pendant ce temps, préparez la bibliothèque pour le chargement.
(a) Dans un nouveau tube PCR, mélangez 37,5 μl de RRB et 37,5 μl de bibliothèque d'ARN dans de l'eau sans nucléase. Ouvrez délicatement le couvercle du port SpotON. Chargez 200 μl du mélange de amorçage dans le port d'amorçage (pas dans le port d'échantillon SpotON). Réglez la pipette de 200 μl sur 75 μl. Mélangez la bibliothèque préparée en pipetant de haut en bas avant de la charger dans le port d'échantillon. Chargez les 75 μl d'échantillon dans le port d'échantillon SpotON goutte à goutte. Fermez le port SpotON, fermez le port d'amorçage et fermez le couvercle du MinION Mk1B.
7. Séquençage : Double-cliquez sur l'icône MinKNOW située sur le bureau pour ouvrir l'interface graphique MinKNOW. Cliquez sur le bouton "Nouvel expérience" et remplissez les informations en fonction de votre expérience, telles que l'ID/nombre de l'échantillon. Choisissez le kit RNA002. Cliquez sur "Démarrer l'exécution." En cas d'option d'appel de base en temps réel, assurez-vous que l'ordinateur dispose de suffisamment de ressources pour faire fonctionner un MinION sans détérioration des performances.

Référence :

1. Wongsurawat T, Jenjaroenpun P, Nookaew I. Séquençage direct de l'ARN et identification des modifications de l'ARN à l'aide de Nanopore[M]//Génomique fonctionnelle de la levure : Méthodes et protocoles. New York, NY : Springer US, 2022 : 71-77.