Protocole de séquençage métagénomique

Extraction d'ADN

Extraction d'ADN à partir de sol ou de sédiment

Pesez 0,5 g de billes de verre dans un tube Eppendorf de 2 ml.
2. Dans ce tube, pesez 0,5 g de sol ou de sédiment qui a été préalablement homogénéisé en remuant avec une spatule stérile.
Ajoutez 0,5 ml de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 8 (utilisez-le pour rincer le tube avec l'échantillon).
Ajoutez 0,5 ml de phénol-chloroforme-alcool isoamyle dans le tube.
5. Battre avec des billes à 8 000 × g pendant 30 s, mettre sur glace pendant 30 s, et répéter pendant encore 30 s.
6. Centrifuger pendant 5 minutes à 16 000 × g (4 °C).
7. Transférez le surnageant dans un tube propre de 2 ml.
8. Ajoutez un volume égal (~500 ml) de chloroforme-alcool isoamyle et vortexez pour mélanger.
9. Centrifuger pendant 5 minutes à 16 000 × g, à 4°C.
10. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 2 ml.
11. Ajouter 2× le volume d'éthanol à 100 % glacé et 1/10 du volume d'acétate de sodium, puis mélanger. Pour l'extraction d'ARN, utiliser 2,5× le volume d'éthanol.
Précipiter pendant au moins 1 h au congélateur.
Centrifuger pendant 30 minutes à 16 000 × g.
14. Pipettez et jetez le liquide, en faisant attention au culot.
Lavez avec 200 ml d'éthanol à 70 %, vortexez pour mélanger.
Centrifuger pendant 10 minutes à 16 000 × g.
17. Répétez les deux dernières étapes et éliminez l'éthanol restant à l'aide d'une pipette. Faites attention au culot.
18. Laissez sécher à l'air pendant 10 minutes. Resuspendre les pellets dans de l'eau stérile.

Extraction d'ADN à partir d'eau de mer

Filtrer 10-15 L d'eau de mer à travers un filtre GF/A de 140 mm de diamètre et 1,6 mm d'épaisseur, afin de réduire l'abondance des cellules eucaryotes et de maximiser la proportion de cellules procaryotes.
2. Appliquez le filtrat directement sur un filtre Sterivex de 0,22 mm.
3. Après filtration, pompez la cartouche Sterivex à sec, puis congelez rapidement dans de l'azote liquide et conservez à -80°C jusqu'à l'isolement de l'ADN.
4. Décongelez la cartouche Sterivex sur de la glace.
Ajoutez 1,6 ml de tampon de lyse SET directement sur le dessus de Sterivex à l'aide d'une seringue de 2,5 ml avec une aiguille de 25G 5/8".
Ajoutez 180 ml de lysozyme frais et scellez le sterivex.
7. Incuber à 37°C pendant 30 minutes sous rotation continue dans un four Hybaid.
Ajoutez 200 ml de SDS (10 % p/v) et 55 ml de protéinase K fraîche (20 mg/ml).
9. Incuber à 55°C pendant 2 h avec rotation continue dans un four Hybaid.
10. Retirez le lysat de Sterivex à l'aide d'une seringue de 5 ml.
Ajoutez 1 ml de tampon SET frais à Sterivex et faites tourner pour rincer.
12. Retirez le tampon SET dans la même seringue de 5 ml.
Ajoutez le lysat dans un tube Maxtract de 15 ml contenant 2 ml de phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25:24:1), pH 8.
14. Secouez doucement jusqu'à ce que le mélange soit homogène. Ensuite, centrifugez à 1 500 × g pendant 5 minutes.
Ajoutez 2 ml supplémentaires de phénol-chloroforme-alcool isoamyle (25:24:1). Secouez doucement jusqu'à homogénéisation et centrifugez à 1 500 × g pendant 5 minutes.
Ajoutez 2 ml de chloroforme-alcool isoamylique (24:1). Secouez doucement jusqu'à ce que le mélange soit homogène et centrifugez à 1 500 × g pendant 5 minutes.
17. Décantez la phase aqueuse dans un tube de centrifugeuse stérile de 20 ml et ajoutez 0,5 V de l'acétate d'ammonium à 7,5 M. Mélangez brièvement, puis ajoutez 2,5 V d'éthanol pur.
18. Mélanger et laisser à −20°C pendant plus d'1 h (une nuit est acceptable).
19. Centrifuger à 10 000 × g pendant 30 min à 4 °C et décantation de l'éthanol.
Ajoutez 2 ml d'éthanol à 80 % et rincez le tube, puis centrifugez à 10 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C et décantez l'éthanol.
21. Répétez l'étape de lavage ci-dessus.
22. Décantez l'éthanol et laissez-le inversé pendant 15 minutes dans la hotte.
23. Suspendre la pellet invisible dans 200 ml d'eau stérile. Laisser sur glace pendant environ 1 h en tapotant fréquemment le tube pour rincer les parois.
24. L'ADN peut être quantifié en le visualisant à l'aide d'une électrophorèse sur gel d'agarose ou en utilisant toute technique standard de quantification de l'ADN.
25. Pour la pyroséquençage, il est nécessaire d'avoir environ 5 mg d'ADN, que cette technique produira en excès. Idéalement, l'ADN devrait être à une concentration d'environ 500 ng/ml.

Séquençage

1. L'ADN doit être mesuré avec précision. La quantité idéale est de 3 à 5 mg pour une bibliothèque de fragments, mais il est possible d'utiliser moins avec succès. Il doit également avoir un poids moléculaire raisonnable pour maximiser la fragmentation aléatoire.
2. L'ADN dans un volume de 100 ml est mélangé avec 500 ml de tampon de nébulisation fourni avec le kit de bibliothèque. L'ADN est fragmenté en le plaçant dans un récipient de nébulisation et en connectant ce dernier à du gaz azote à 30 psi pendant 1 minute.
3. L'ADN est récupéré de la chambre de nébulisation et nettoyé avec le kit du fabricant en suivant les instructions fournies par le kit, en utilisant 2,5 ml de tampon PB et en élution de l'ADN dans 100 ml de tampon d'élution.
4. À ce stade, les petits fragments sont éliminés à l'aide de billes AMPure. Une quantité calibrée est ajoutée à l'ADN afin que le matériel de moins de 300 pb reste en solution. L'ADN de poids moléculaire plus élevé se lie aux billes, est lavé avec de l'éthanol à 70 %, est séché et est récupéré par élution dans un tampon Tris-HCl à 10 mM pH 7,5.
5. L'ADN est vérifié (1 ml d'aliquot) pour la distribution de taille.
6. D'autres manipulations sont toutes décrites dans le kit de bibliothèque. Les extrémités de l'ADN sont polies, les adaptateurs (avec ou sans codes-barres) ajoutés, les fragments contenant des adaptateurs sélectionnés sur des billes Dynal, et les extrémités remplies. La bibliothèque à brins simples est récupérée par fusion des billes Dynal avec du NaOH (0,125 N) conformément aux instructions du fabricant et purifiée avec une colonne MinElute.
7. La bibliothèque est évaluée en utilisant un picochip RNA.
8. Une quantité prédéterminée de la bibliothèque est utilisée pour mettre en place une réaction de PCR en émulsion en utilisant soit le kit à grand volume, soit le kit à petit volume. Cela implique de lier l'ADN à des billes de capture spécifiques à l'un des adaptateurs.

Référence :

1. Gilbert J A, Laverock B, Temperton B, et al. Métagénomique[M]//Séquençage de nouvelle génération à haut débit. Humana Press, Totowa, NJ, 2011 : 173-183.