Protocole de séquençage MeDIP

Fragmentation de l'ADN

1. Extraire l'ADN génomique en fonction des cellules ou des tissus étudiés.
2. Soniquez l'ADN génomique purifié.
3. Diluez 6 μg d'ADN génomique dans 130 μl (volume final) de tampon TE 1× et pipetez dans le tube Covaris approprié.
4. Réglez Covaris sur le programme de taille de fragment de 300 pb.
5. Exécutez le programme pour chaque tube.
6. Charger 5 ou 10 μl (environ 400–500 ng) d'ADN génomique fragmenté et 10 μl d'échelle d'ADN sur un gel d'agarose à 1,5 % pour vérifier la taille des fragments. De l'ADN non soniqué (100–200 ng) peut être chargé sur le même gel à titre de comparaison.

Ajout d'anticorps

1. Mesurer le volume de l'ADN soniqué après la course de gel et le diluer avec un tampon TE 1× à 400 μl.
2. Dénaturer par chaleur dans un bloc de chauffage à sec pendant 10 minutes à 95 °C et refroidir immédiatement sur glace pendant 10 minutes.
3. Tout en maintenant l'échantillon au frais, ajoutez 100 μl de 5× IP froid et 4–5 μg d'anticorps (anticorps monoclonal de souris anti 5-méthylcytidine) à l'ADN dénaturé soniqué. Incubez le mélange ADN-anticorps toute la nuit sur un rotateur à 4 °C.

Lier des billes au mélange ADN-anticorps

1. Pré-laver les billes magnétiques (Nous utilisons des Dynabeads M-280 anti-IgG de mouton) comme suit : Resuspendre soigneusement les billes en pipetant de haut en bas ou en les faisant tourner. Elles doivent être dans une solution homogène et, si vous traitez plusieurs échantillons, elles doivent être resuspendues fréquemment car elles se déposent rapidement.
2. Transférez le volume total nécessaire (50 μl par échantillon) dans un tube centrifuge, ajoutez le même volume de tampon de lavage (au moins 1 ml) et resuspendez.
3. Placez le tube dans un support magnétique pendant 1 à 2 minutes et jetez le surnageant.
4. Resuspendre les billes dans 1 ml de tampon de lavage et incuber pendant 1 min sur glace. Placer le tube sur un aimant pendant 1 à 2 min et jeter le surnageant.
5. Retirez le tube du support magnétique et resuspendre les billes lavées dans le même volume de tampon IP 1× que le volume initial des billes.
Ajoutez 50 μl de billes au mélange d'ADN-anticorps de 500 μl obtenu à l'étape 2.
7. Incuber pendant 2 h sur une plateforme rotative à 4 °C.

Lavage du mélange ADN-Anticorps-Billes

1. Après l'incubation de 2 h, laver les billes trois fois avec le tampon IP 1× comme suit : Placer le tube dans un support magnétique pendant 1 à 2 min et jeter le surnageant. Retirer le tube du support magnétique. Ajouter 1 ml de tampon IP 1× froid. Mélanger en inversant le tube ou en vortexant doucement. Incuber le tube pendant 1 min sur glace. Placer le tube dans le support magnétique pendant 1 à 2 min et jeter le surnageant. Répéter deux fois pour un total de trois lavages.
2. Resuspendre les billes dans 250 μl de tampon de digestion.
Ajoutez 3,5 μl de protéinase K (20 mg/ml) aux billes resuspendues.
4. Incuber pendant 2 à 3 heures sur une plateforme rotative à 55 °C.

Purification de l'ADN

1. Retirez le parafilm et ajoutez 250 μl de phénol–chloroforme–alcool isoamylique dans chaque tube. Vortexez pendant 30 s et centrifugez à 14 000 × g pendant 5 min à température ambiante. Retirez le surnageant aqueux et transférez-le dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
2. Ajoutez 250 μl de chloroforme au surnageant de l'étape 1. Vortexez brièvement et centrifugez à 14 000 × g pendant 5 minutes à température ambiante. Retirez le surnageant aqueux et transférez-le dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
Ajoutez 2 μl du coprécipitant GlycoBlue (20 mg/ml, Life Technologies) et mélangez bien.
Ajoutez 20 μl de NaCl 5 M, puis 500 μl d'éthanol à 100 %. Mélangez bien.
Précipiter dans un congélateur à -20 °C pendant 1 h à une nuit.
6. Centrifugez à 14 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant sans perturber le pellet bleu.
7. Lavez une à deux fois avec 1 ml d'éthanol à 70 % en incubant à −20 °C pendant 10 minutes, puis centrifugez à nouveau pendant 10 minutes. Jetez le surnageant. Ensuite, centrifugez à nouveau brièvement pour rassembler le liquide résiduel au fond du tube et retirez tout le liquide avec une pointe de pipette pour chargement de gel ou une autre pointe fine.
8. Laissez sécher les échantillons à l'air sur le banc.
9. Resuspendre dans 25 μl d'eau sans nucléase.
10. Mesurez la concentration d'ADN.

Bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération

1. Étant donné que les fragments d'ADN récupérés par MeDIP sont simples brins, la première étape doit produire de l'ADN double brin pour la préparation de la bibliothèque.
Utilisez entre 10 et 1000 ng de fragments d'ADN simple brin et hybridisez 10 ng/μl de primers hexamères aléatoires à l'échantillon en le chauffant dans un thermocycleur à 95 °C, puis refroidissez immédiatement sur de la glace.
3. Effectuer la synthèse de la seconde chaîne d'ADN, ce qui, si vous utilisez le kit NEB mentionné ci-dessus, correspondrait à l'étape 1.4.
4. Suivez le reste du protocole du fabricant pour recevoir les bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération.
5. Déterminez le rendement de la bibliothèque à l'aide du kit Qubit High Sensitivity dsDNA, puis effectuez un contrôle de qualité pour la taille des fragments et la concentration/molarité.
6. Les bibliothèques sont séquencées sur les séquenceurs disponibles pour vous, par exemple Illumina HiSeq.

Référence :

1. Ben Maamar M, Sadler-Riggleman I, Beck D, et al. Cartographie à l'échelle du génome de la méthylation de l'ADN 5mC par immunoprécipitation de l'ADN méthylé (MeDIP)-séquençage[J]. Modifications de l'ADN : Méthodes et Protocoles, 2021 : 301-310.