Préparation de bibliothèque de séquençage à partir d'ADN dégradé - Protocole

Fragments d'ADN à extrémités franches

1. Préparer le mélange maître pour la réparation à extrémité franche. Inclure par réaction :
(a) 5,0 μL de tampon de réparation de fin 5×.
(b) 0,25 μL d'enzyme de terminaison franche.
Distribuez 5,25 μL du mélange dans chaque tube PCR étiqueté.
Ajoutez 19,5 μL d'extraction d'ADN dans chaque tube PCR individuel (ou complétez le volume final à 25 μL en ajoutant de l'eau distillée déionisée).₂O, conformément au volume initial du modèle).
4. Incubez le mélange dans un thermocycleur pendant 20 minutes à 20 °C, puis inactivez l'enzyme par incubation pendant 20 minutes à 72 °C.

Ligation d'adaptateur

1. Retirez le tube contenant l'ADN à bout émoussé du thermocycleur et conservez-le sur de la glace.
2. Préparez le mélange de réaction de ligation d'adaptateur, y compris par réaction :
(a) 2,5 μL de tampon Ligase 10×.
1,0 μL d'adaptateur P1.
(c) 0,5 μL de mélange de dNTP.
(d) 0,5 μL de ligase ADN.
(e) 2,0 μL de polymérase de réparation de Nick.
Distribuez 6,5 μL du mélange dans un nouveau tube PCR.
Ajoutez 1,0 μL de chacun des codes-barres PGM choisis dans le tube PCR de chaque échantillon respectif.
Ajoutez 20,5 μL d'ADN à bouts francs.
6. Incubez le mélange dans un thermocycleur pendant 15 minutes à 25 °C, suivi de 5 minutes à 72 °C.

Purification des billes

1. Préparez une solution d'éthanol à 70 % fraîche, avec un volume final d'au moins 500 μL × nombre d'échantillons.
Ajoutez 40 μL de billes SPRIselect au produit du sous-titre 3.3, pour un rapport final de 1,8× (ce qui devrait donner une large gamme de tailles de fragments récupérés et une limite supérieure d'environ 200 pb).
3. Mélangez soigneusement en pipetant, puis laissez les tubes incuber pendant 1 minute dans le support magnétique.
4. Retirer le surnageant sans perturber les billes magnétiques.
5. Ajoutez 500 μL d'éthanol à 70 % fraîchement préparé à chaque échantillon, mélangez bien et laissez les tubes incuber jusqu'à ce que toutes les billes soient capturées par le support magnétique.
6. Retirez le surnageant sans perturber les billes magnétiques et laissez-les sécher à l'air pendant un maximum de 5 minutes.
Ajoutez 20 μL de ddH₂Pour éluer l'ADN, mélangez bien et laissez les tubes reposer pendant une minute supplémentaire dans le support magnétique.
8. Retirez l'élution et transférez-la dans un nouveau tube (étiqueté), gardez au frais jusqu'à la prochaine réaction.

Amplification

1. Diluez les amorces en ajoutant 10 μL de solution mère d'amorce (à 100 μM) dans 90 μL de ddH.₂O.
2. Distribuez 15 μL dans chaque tube PCR, puis ajoutez 5,0 μL du produit purifié.
3. Dans l'ADN moderne, configurez et exécutez le thermocycleur avec le protocole suivant : dénaturation pendant 10 minutes à 94 °C, suivie de 15 cycles de 30 secondes à 94 °C, 45 secondes à 60 °C et 45 secondes à 72 °C. L'extension finale se fait à 72 °C pendant 5 minutes.
4. Regroupez toutes les amplifications parallèles pour le même échantillon, en élution des bibliothèques de séquençage dans 20 μL.
5. Visualiser la concentration de la bibliothèque et la distribution de la taille des fragments.

Référence :

1. Martins R F, Kampmann M L, Förster D W. Préparation de bibliothèques de séquençage à partir d'échantillons dégradés pour des plateformes de séquençage non-Illumina. ADN ancien : Méthodes et Protocoles, 2019 : 85-92.