Préparation de la bibliothèque pour le protocole de séquençage de l'ARNr 16S

Réaction de polymérase en chaîne (PCR)

1. Préparez et nettoyez la station de travail, la hotte PCR ou la cabine de biosécurité.
2. Décongelez et conservez les réactifs sur de la glace, vortexez doucement et centrifugez avant utilisation.
Préparez la réaction de PCR en triplicat avec les réactifs suivants dans des tubes de PCR ou une plaque à 96 puits. Eau sans nucléase, 13,0 μL ; Master Mix PCR, 10,0 μL ; amorce avant 515f (10 μM), 0,5 μL ; amorce arrière 806r (10 μM), 0,5 μL ; et ADN modèle, 1,0 μL.
3. Allumez le thermocycleur à l'avance pour que l'instrument se réchauffe.
4. Avant de placer les tubes ou la plaque dans le thermocycleur, centrifugez-les à 290 × g pendant 1 minute pour rassembler les réactifs au fond du tube ou du puits.
5. Introduisez les tubes ou la plaque dans le thermocycleur et configurez les conditions de cycle suivantes :
(a) 94 °C pendant 3 min.
(b) 94 °C pendant 45 s.
(c) 50 °C pendant 60 s.
(d) 72 °C pendant 90 s.
(e) Répétez les étapes (a–d) 35 fois pour un total de 35 cycles.
(f) 72 °C pendant 10 min.
(g) Conserver à 4 °C.
6. Une fois terminés, les échantillons peuvent être stockés en toute sécurité à 4 °C ou à − 20 °C à ce stade. Évitez les cycles de congélation-dégel.
7. Après amplification, regroupez des échantillons tripliqués dans un volume unique de 75 μL.

Électrophorèse sur gel d'agarose

Préparez de l'agarose à 1,5 % dans un tampon TAE 1× dans un flacon. Le volume variera en fonction de la taille de la boîte à gel.
2. Faites chauffer le flacon au micro-ondes pour dissoudre l'agarose et laissez-le bouillir pendant environ 15 secondes. Assurez-vous que la solution est visuellement claire.
3. Ajoutez la quantité appropriée de SYBR Safe DNA Gel Stain (5 μL/50 mL) dans le flacon, puis agitez doucement pour mélanger.
4. Versez lentement le mélange dans le moule à gel, utilisez une pointe de pipette pour éliminer les bulles.
5. Placez un peigne de largeur appropriée dans le gel, utilisez une pointe de pipette pour éliminer les bulles, et laissez le gel reposer pendant environ 25 minutes pour qu'il se solidifie.
6. Une fois que le gel est complètement solidifié, retirez délicatement le peigne en le soulevant tout droit. Ne pas endommager les puits lors du retrait du peigne.
7. Placez le plateau de gel dans la boîte à gel. (Vérifiez l'orientation de la chambre de tampon ; le gel doit courir des électrodes noires aux électrodes rouges.)
Ajoutez un tampon TAE 1× pour à peine immerger le gel mais couvrir complètement les puits.
9. Mélangez chaque échantillon avec un colorant de chargement (par exemple, colorant de chargement 6× : 1 μL de colorant de chargement + 5 μL de produit PCR).
10. Charger l'échelle d'ADN et les échantillons dans les puits du gel.
11. Une fois le chargement des échantillons, y compris le contrôle sans modèle (NTC), terminé dans les différents puits du gel, mettez le couvercle sur la chambre de tampon et branchez les cordons dans la boîte d'électrophorèse.
12. Allumez la boîte d'électrophorèse et réglez la tension et le temps de course appropriés ; réglez sur constant en volts.
13. Lorsque le gel a terminé de migrer, retirez le plateau du gel de la chambre de tampon et insérez délicatement un transilluminateur UV ou un imageur pour visualiser le gel et la bande attendue de l'amplicon.

Quantification et Normalisation

1. Quantifiez les amplicons PCR en utilisant un kit de quantification de l'ADN. Nous avons utilisé le kit d'essai Quant-iT PicoGreen dsDNA en suivant les instructions du fabricant.
2. Après la quantification de chaque pool d'échantillons, transférer des quantités équivalentes de 240 ng d'amplicon de chaque échantillon dans un tube stérile ou des tubes.

Nettoyage du produit PCR

1. Utilisez un kit de purification PCR pour les produits PCR regroupés. Le kit de purification PCR QIAquick est utilisé conformément aux instructions du fabricant.
2. La bibliothèque de pool nettoyée éludée devrait être prête pour soumission à une installation de séquençage. La meilleure assurance qualité et contrôle qualité (AQ/CQ) consiste à quantifier la bibliothèque totale par PCR quantitative (qPCR).

qPCR

1. Utilisez le KAPA Library Quantification Kit pour les plateformes Illumina en suivant les instructions du fabricant.
Une fois que la bibliothèque est quantifiée avec précision par qPCR, elle devrait être prête pour le séquençage.
Cette bibliothèque doit être réalisée sur un séquenceur Illumina MiSeq en utilisant une chimie à paires d'extrémités 2 × 250.

Référence :

1. Maldonado J, Yaron J R, Zhang L, et al. Préparation de bibliothèques de séquençage de nouvelle génération pour l'analyse du microbiome 16S rRNA après traitement par des serpines[J]. Serpins : Méthodes et Protocoles, 2018 : 213-221.