Identification des modifications d'ARN m6A par le protocole de séquençage Nanopore

Préparation de la bibliothèque de séquençage d'ARN direct

Préparation de l'ARN d'entrée

1. Regroupez chaque curlcake (pour les non modifiés et les modifiés m6A séparément) dans un tube LoBind pour ADN qui contiendra 200 ng de chacun (800 ng au total).
2. Ajustez le volume à 9μL avec de l'eau sans nucléase et mélangez soigneusement par inversion.
3. Centrifugez brièvement dans un microfuge.
Ligation d'adaptateur
1. Dans un tube PCR à paroi fine de 0,2 mL, mélangez les réactifs du kit de séquençage RNA direct.
2. Mélangez par pipetage et centrifugez.
3. Incubez la réaction pendant 10 minutes à température ambiante. En attendant, passez à l'étape de transcription inverse.

Transcription inverse et nettoyage

1. Mélangez les réactifs pour préparer le mélange maître de transcription inverse.
2. Ajoutez le mélange maître au tube PCR de 0,2 mL contenant l'ARN ligaturé avec l'adaptateur RT de l'étape "Ligation de l'adaptateur RT" ci-dessus. Mélangez en pipetant.
Ajoutez 2μl de transcriptase inverse SuperScript III à la réaction et mélangez en pipetant.
4. Placez le tube dans un cycler thermique, incubez à 50 °C pendant 50 minutes et à 70 °C pendant 10 minutes, puis refroidissez l'échantillon à 4 °C avant de passer à l'étape suivante.
Transférez l'échantillon dans un tube Eppendorf LoBind de 1,5 mL.
6. Resuspendre le stock de billes Agencourt RNAClean XP en vortexant, ajouter 72μL de billes à la réaction de transcription inverse et mélanger par pipetage.
7. Incuber sur un mélangeur Hula pendant 5 minutes à température ambiante.
Préparez 200 μL de 70 % d'éthanol frais dans de l'eau sans nucléase.
9. Faites tourner l'échantillon et précipitez sur un aimant.
10. Gardez le tube sur l'aimant et lavez les billes avec 150 μL d'éthanol à 70 % sans perturber le culot.
11. Retirez l'éthanol et jetez-le. Centrifugez les tubes, replacez-les sur le support magnétique et éliminez tout résidu d'éthanol.
12. Retirez le tube du support magnétique et resuspendre le culot dans 20 μL d'eau sans nucléase. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
13. Peler les billes sur l'aimant jusqu'à ce que l'éluté soit clair et incolore.
Pipettez 20 μL de l'éluate dans un tube Eppendorf DNA LoBind propre de 1,5 mL.
15. Mesurer l'ADNc et l'ARN sur un Qubit ou un appareil similaire.

Ligation et nettoyage de l'adaptateur RMX

Dans un tube Eppendorf DNA LoBind de 1,5 mL propre, mélangez les réactifs.
2. Mélangez par pipetage et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
3. Resuspendre le stock de billes Agencourt RNAClean XP par vortexage, ajouter 40 μL de billes à la réaction de ligature des adaptateurs et mélanger par pipetage.
4. Incuber sur un mélangeur Hula pendant 5 minutes à température ambiante.
5. Faites tourner l'échantillon pour le précipiter sur un aimant. Gardez le tube sur un aimant et pipettez le surnageant.
6. Ajoutez 150μL du tampon de lavage (WSB) fourni dans le kit de séquençage RNA direct aux billes. Resuspendez les billes en tapotant le tube. Remettez le tube sur le support magnétique, laissez les billes se déposer et pipettez le surnageant. Répétez. Laissez sécher à l'air pendant 2 minutes.
7. Retirez le tube du support magnétique et resuspendez le culot dans 21 μl de tampon d'élution. Incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
8. Pélletez les billes sur l'aimant jusqu'à ce que l'éluate soit clair et incolore.
9. Retirez et conservez 21 μL d'éluate dans un tube Eppendorf DNA LoBind clair de 1,5 mL.
10. Mesurer l'ADNc et l'ARN sur un Qubit ou un appareil similaire.
11. Mélangez la bibliothèque avec 17,5 μl d'eau.
12. Ajoutez 37,5 μL de tampon RRB (mélangez le RRB en le vortexant avant utilisation) et mélangez bien. La bibliothèque est maintenant prête à être chargée dans la cellule de flux.

Référence :

1. Liu H, Begik O, Novoa E M. EpiNano : Détection des modifications d'ARN m6A utilisant le séquençage d'ARN direct Oxford Nanopore[M]//Modifications de l'ARN. Humana, New York, NY, 2021 : 31-52.