Méthode de typage HLA en longueur complète utilisant le protocole de séquençage PacBio SMRT

Génération d'amplicons HLA

Extraction d'ADN

1. Pipetez 20 μl de protéinase K au fond d'un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml.
2. Ajoutez 200 μl d'échantillon de sang suivi de 200 μl de tampon AL dans le tube de microcentrifugeuse. Mélangez l'échantillon par vortexage par impulsion pendant 15 s.
3. Incuber à 56 °C pendant 10 minutes.
4. Centrifuge le contenu et ajoutez 200 μl d'éthanol (96-100%) à l'échantillon.
5. Mélangez à nouveau par impulsion de vortexage de 15 secondes, puis centrifugez pour éliminer les gouttes à l'intérieur du couvercle.
6. Centrifuger à 6000 × g (8000 tr/min) pendant 1 minute.
7. Jetez le tube de collecte contenant le filtrat et placez la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.
8. Ajoutez 500 μl de tampon AW1 sans mouiller le bord et centrifugez à 6000 × g (8000 rpm) pendant 1 minute.
9. Placez la colonne de centrifugation dans un autre tube de collecte propre de 2 ml et jetez le tube de collecte contenant le filtrat.
Ajoutez 500 μl de tampon AW2 à la colonne sans mouiller le bord. Fermez le capuchon et centrifugez à pleine vitesse (20 000 × g ; 14 000 rpm) pendant 3 minutes.
11. Remettez la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de collecte de 2 ml et jetez l'ancien tube de collecte avec le filtrat.
12. Centrifugez la colonne à pleine vitesse pendant 1 minute.
13. Placez la colonne de centrifugation dans un tube microcentrifuge propre de 1,5 ml et jetez le tube de collecte contenant le filtrat.
14. Ajoutez 200 μl de tampon AE ou d'eau distillée. Incubez à température ambiante (15-25 °C) pendant 1 minute, puis centrifugez à 6000 × g (8000 rpm) pendant 1 minute.

Évaluation de la qualité et de la quantité de l'ADN

1. Analyser la qualité de l'ADN sur un gel d'agarose à 1 % (p/v) en utilisant 3 μl d'ADN extrait.
2. Quantifiez l'ADN en utilisant 1 μl d'ADN et analysez selon le protocole du fabricant.

Amplification PCR des gènes HLA en longueur complète

1. Toutes les réactions doivent être réalisées sur glace.
2. Décongeler le tampon PCR Long Range 10×, le mélange de dNTP, H sans nucléase.₂O, et solutions de primer. Mélangez les solutions soigneusement et centrifugez brièvement avant utilisation.
3. Préparez un mélange de réaction. Préparez un mélange de réaction séparé pour chaque amorce d'amplification.
4. HLA-DQB1 nécessite l'ajout de Q-Solution et le double de la quantité d'enzyme Long-Range par réaction.
5. Vortexez le mélange de réaction soigneusement, puis centrifugez brièvement.
6. Ajoutez le mélange de réaction dans chaque tube PCR. Le volume approprié est de 25 μl moins la quantité d'ADN ajoutée à l'étape suivante.
7. Ajoutez 1-4 μl d'ADN modèle (50-200 ng) à chaque tube contenant le mélange de réaction.
8. Programmez le thermocycleur selon les instructions du fabricant.
9. Après amplification, conservez les échantillons toute la nuit à 2-8 °C.

Évaluation de la qualité des amplicons PCR

1. Quantifiez les amplicons des gènes de classe I et II en utilisant 1 μl de l'essai PCR et analysez selon le protocole du fabricant.
2. Analyser les produits de PCR sur un gel d'agarose à 1 % p/v en utilisant 3 μl de chaque essai de PCR.
3. Confirmer la taille de l'amplicon par PCR.

Purification du produit PCR

Tous les amplicons des gènes de classe I et II ont été purifiés à l'aide d'un kit.
2. Conservez les billes AMPure à température ambiante pendant une demi-heure.
Ajoutez 0,6× de billes AMPure (par exemple, pour 100 μl, ajoutez 60 μl de billes AMPure) à l'amplicon PCR et mélangez en pipetant de haut en bas.
4. Faites tourner le tube pour collecter les billes et laissez-le à température ambiante pendant 15 minutes.
5. Gardez le tube dans un support à billes magnétiques jusqu'à ce que les billes se rassemblent sur le côté du tube et que la solution apparaisse claire.
6. Gardez les tubes sur le support à billes magnétiques et transférez le surnageant clarifié dans un autre tube en pipetant.
7. Ne retirez pas le tube du support à billes magnétiques et ajoutez de l'éthanol à 70 % fraîchement préparé dans le tube Eppendorf du côté opposé aux billes.
8. Utilisez un volume suffisant d'éthanol à 70 % pour remplir le tube sans perturber les billes. Laissez le tube reposer pendant 30 secondes.
9. Après 30 s, pipettez et jetez l'éthanol à 70 %.
10. Répétez les étapes 6 à 8 ci-dessus.
11. Éliminez l'éthanol résiduel à 70 % par une courte centrifugation et replacez sur le support magnétique.
12. Aspirez tout l'éthanol à 70 % restant.
13. Laissez les perles sécher à l'air (avec les bouchons de tube ouverts) pendant 30 à 60 secondes.
14. Retirez le tube du support magnétique et ajoutez 50 μl de tampon d'élution à l'échantillon. Éluiez l'ADN des billes.
15. Vortexez pendant 30 s et incubez à température ambiante pendant 10 min.
16. Remettez le tube sur le support magnétique pour éluer l'échantillon des billes et transférez l'échantillon dans un tube frais.

Évaluation de la qualité de l'amplicon PCR purifié

1. Quantifiez les amplicons purifiés des gènes de classe I et II en utilisant 1 μl d'ADN et analysez selon le protocole du fabricant.
2. Vérifiez la taille de l'amplicon et des réactifs conformément au protocole du fabricant.
3. Confirmez la taille des amplicons selon la taille attendue.

Préparation de bibliothèque HLA SMRTbell

1. Préparez la bibliothèque SMRTbell en utilisant le kit de préparation de modèles SMRT conformément au protocole du fabricant. Le protocole de préparation de modèles SMRT se compose des étapes suivantes.
2. Pooling équimolaire d'amplicons PCR purifiés.
3. Réparer les dommages à l'ADN.
4. Purifiez l'ADN réparé.
5. Ligation à extrémité émoussée des adaptateurs SMRTbell aux amplicons réparés à l'extrémité.
6. Ajouter l'exonucléase et incuber.
7. Purifiez les modèles SMRTbell.
8. Évaluation de la qualité de la bibliothèque SMRTbell.
9. Analyser les amorces aux modèles SMRTbell.
10. Lier la polymérase aux modèles SMRTbell.

Pooling équimolaire d'amplification PCR purifiée

1. Regrouper la concentration molaire égale de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1 et HLA-DRB1 en un seul échantillon.
2. Maintenez le volume cible du pool final (μl) à 20 μl et la concentration cible par amplicon (nM) pour le pool équimolaire à 4 nM.

Réparer les dommages à l'ADN dans les amplicons

1. Décongelez le composant du kit sur de la glace et ajoutez les réactifs dans un tube microfuge.
2. Mélangez le contenu en pipetant et centrifugez le contenu du tube.
3. Incuber à 37 °C pendant 20 minutes ou plus, puis retourner la réaction à 4 °C pendant 1 minute.

Purifiez l'ADN réparé

1. Ramenez le réactif à billes à température ambiante et mélangez-le bien jusqu'à ce que la solution apparaisse homogène.
Ajoutez 0,6× le volume de billes magnétiques AMPure PB à la réaction de réparation des extrémités et mélangez en pipetant de haut en bas.
3. Faites tourner (ou pulsez) le tube pour collecter les billes et transférez le tube à un mélangeur vortex.
4. Permettez à l'ADN de se lier aux billes en agitant à 2000 tr/min pendant 10 minutes à température ambiante jusqu'à ce que le mélange billes/ADN apparaisse homogène.
5. Faites tourner le tube pendant quelques secondes pour collecter les billes.
6. Placez le tube dans un support à billes magnétiques jusqu'à ce que les billes se rassemblent sur le côté du tube et que la solution apparaisse claire.
7. En maintenant les tubes sur le support à billes magnétiques, transférez le surnageant clarifié dans un autre tube en le pipetant.
8. Ne retirez pas le tube du support à billes magnétiques et ajoutez de l'éthanol à 70 % fraîchement préparé dans le tube Eppendorf du côté opposé aux billes.
9. Utilisez un volume suffisant d'éthanol à 70 % pour remplir le tube sans déranger les billes. Laissez le tube reposer pendant 30 secondes.
10. Après 30 s, pipettez et jetez l'éthanol à 70 %.
11. Répétez les étapes 6 à 8 ci-dessus.
12. Éliminez l'éthanol résiduel à 70 % par une courte centrifugation et remettez-le sur le support magnétique.
13. Aspirez tout l'éthanol à 70 % restant.
14. Laissez les perles sécher à l'air (avec les bouchons de tube ouverts) pendant 30 à 60 secondes.
15. Retirez le tube du support magnétique et ajoutez 34 μl de tampon d'élution à l'échantillon. Éluiez l'ADN des billes.
16. Vortex pendant 10 minutes à 2000 tr/min.
17. Remettez le tube sur le support magnétique pour éluer l'échantillon des billes et transférez l'échantillon dans un nouveau tube.
18. L'ADN réparé peut être conservé pendant la nuit à 4 °C ou à −20 °C pour une durée plus longue.

Ligation à extrémité émoussée des adaptateurs SMRTbell aux amplicons réparés à l'extrémité

1. Décongelez les réactifs sur glace et mélangez-les dans un tube de microcentrifugeuse selon le protocole du fabricant.
2. Ajoutez l'adaptateur à l'ADN tandis que tous les autres composants doivent être ajoutés au Master Mix. Complétez le volume total à 40 μl avec de l'eau.
3. Mélangez bien la réaction en pipetant et centrifugez le contenu du tube.
4. Incuber à 25 °C pendant 15 minutes.
5. Incuber à 65 °C pendant 10 minutes pour inactiver la ligase et conserver à 4 °C.
6. Ne vous arrêtez pas et continuez en ajoutant l'exonucléase après cette étape.

Ajouter l'exonucléase et incuber

1. Décongelez le réactif sur glace et mélangez bien la réaction en pipetant.
2. Faites tourner rapidement le contenu du tube dans une microcentrifugeuse.
3. Ajoutez les réactifs selon le protocole du fabricant, mélangez par pipetage et centrifugez.
4. Incuber à 37 °C pendant 1 h, puis remettre la réaction à 4 °C.

Évaluation de la qualité de la bibliothèque SMRTbell

1. Quantifiez les bibliothèques en utilisant 1 μl d'ADN selon le protocole du fabricant.
2. Vérifiez la taille de la bibliothèque.

Annelage des amorces aux modèles SMRTbell

1. Dans la calculatrice, cliquez sur l'option nombre de cellules SMRT qui spécifie combien de cellules SMRT préparer, et la calculatrice détermine la quantité d'échantillon nécessaire.
2. Ajouter la concentration de la bibliothèque et la taille des bibliothèques.
3. Protocole : Sélectionnez la méthode de chargement comme MagBead.
4. Kit de liaison : Sélectionnez la polymérase de séquençage comme P6v2.
5. Protocole de préparation : Petite échelle.
6. Stockage à long terme : Non.
7. Complexe de contrôle de l'ADN : Oui.
8. Réutilisation complexe : Non.
9. Concentration standard : Oui
10. Cliquez sur la section Paramètres personnalisés.
11. Concentration sur la plaque : Utilisez la recommandation par défaut de 0,01 nM.
12. Ratio du complexe de contrôle de l'ADN par rapport au modèle : Utilisez la recommandation par défaut de 1,2 %.
13. Polymérase : Ratio modèle : Utilisez la recommandation par défaut de 10:1.
14. Primer : Ratio de modèle : Utilisez la recommandation par défaut de 20:1.
Pour le guide de conditionnement :
(a) Diluez et préchauffez le primer de séquençage de 5000 à 150 nM dans le tampon d'élution.
(b) Incubez les amorces diluées à 80 °C pendant 2 minutes, puis maintenez à 4 °C.
Pour l'amorçage de recuit :
(a) Dans un tube propre, ajoutez la quantité appropriée de réactifs.
(b) Mélangez le contenu par pipetage, centrifugez brièvement et incubez à 20 °C pendant 30 minutes.
(c) Transférer à un endroit à 4 °C pour une utilisation immédiate ou conserver à −20 °C.

Lier la polymérase aux modèles SMRTbell

1. Décongelez les réactifs pour la dilution de la polymérase et préparez la réaction sur glace.
2. Diluez la polymérase dans un tube de 0,5 ml, mélangez par pipetage et centrifugez brièvement.
3. Pour la liaison de la polymérase, ajoutez les composants, mélangez par pipetage et centrifugez brièvement.
4. Incuber à 30 °C pendant 30 minutes et conserver à 4 °C.

Lier le complexe d'ADN à MagBead

1. Diluez le complexe de contrôle interne de l'ADN.
2. Diluez davantage la première dilution du contrôle d'ADN.
3. Diluez le complexe d'échantillon.
4. Gardez les billes magnétiques au frais.
Ajoutez 73,9 μl de MagBeads dans un tube vide et placez-le sur un support magnétique.
6. Collectez les billes. Retirez le surnageant et jetez-le.
Ajoutez 73,9 μl de tampon de lavage MagBead et lavez en aspirant et en dispensant lentement dix fois.
8. Collectez les billes. Retirez le surnageant et jetez-le.
Ajoutez 73,9 μl de tampon de liaison MagBead et mélangez en aspirant et en dispensant lentement dix fois.
Ajoutez 73,9 μl de billes lavées dans un nouveau tube et placez-le sur un support magnétique.
11. Collectez les billes. Enlevez le surnageant et jetez-le.
Ajoutez 19 μl de complexe d'échantillon dilué et mélangez en aspirant et en dispensant lentement dix fois.
Incuber dans un rotateur à 4 °C pendant 20 minutes (jusqu'à 2 heures).
14. Gardez le tube contenant le complexe MagBead sur une plaque magnétique.
15. Collectez les billes. Retirez le surnageant clair et jetez-le.
Ajoutez 19 μl de tampon de liaison MagBead et mélangez en aspirant et en dispensant lentement dix fois.
17. Collectez les billes en plaçant le tube sur le support magnétique. Retirez le surnageant et jetez-le.
Ajoutez 19 μl de tampon de lavage MagBead et lavez en aspirant et en dispensant lentement dix fois.
19. Collectez les billes en plaçant le tube sur le support magnétique. Retirez le surnageant et jetez-le.
Ajoutez 1,2 μl de dilution de contrôle d'ADN.
Ajoutez 17,8 μl de tampon de liaison MagBead et mélangez en aspirant et en dispensant lentement dix fois.
22. Conserver à 4 °C jusqu'à utilisation.

Séquençage

1. Chargement de la plaque d'échantillons : Transférez les volumes spécifiés (19 μl) dans des puits séparés d'une nouvelle plaque PCR à 96 puits pour traitement sur PacBio RS.
2. Charge les réactifs, les pointes et les cellules SMRT sur le séquenceur et commence le séquençage : Les réactifs et la cellule SMRT varient en fonction du type de séquenceur utilisé, veuillez donc vous référer aux détails.

Référence :

1. Ambardar S, Gowda M. Méthode de typage HLA en pleine longueur à haute résolution utilisant la technologie de séquençage de troisième génération (Pac-Bio SMRT) [M]//Typage HLA. Humana Press, New York, NY, 2018 : 135-153.