Protocole de génotypage HLA en longueur complète par séquençage Nanopore

Introduction à la génotypage HLA complet avec le séquençage Nanopore

gènes HLA présentent un polymorphisme significatif et jouent un rôle essentiel dans le système immunitaire en présentant des antigènes peptidiques aux cellules T. Précis génotypage de ces gènes revêt une importance essentielle pour divers domaines, y compris la transplantation, les études sur l'association des maladies et l'immunothérapie. La technologie de séquençage par nanopore, illustré par des plateformes comme Oxford Nanopore Technologies (ONT), offre la capacité de séquencer de longs fragments d'ADN, fournissant ainsi un outil précieux pour résoudre les segments complexes et répétitifs de HLA gènes.

Le protocole détaillé pour la longueur complète Génotypage HLA avec Séquençage par nanopore est comme suit :

1. Effectuez des PCR longue portée individuelles avec un kit de PCR longue portée approprié en utilisant 50 à 200 ng d'ADN génomique et des amorces pour amplifier. HLA gènes de classe I. Vérifier par électrophorèse sur gel.
2. Réalisez des PCR-MID avec un kit de PCR à long terme approprié en utilisant des codes-barres/MID distincts pour chaque réaction.
3. Regroupez jusqu'à 96 produits MID-PCR. En option, la quantité de produit PCR peut être égalisée en ajustant le volume du produit PCR regroupé en fonction des intensités des bandes d'électrophorèse sur gel.
4. Purifiez 400 μl du pool d'amplicons avec des billes SPRIselect dans un rapport volume billes/DNA de 0,6×. Assurez-vous que les billes sont complètement suspendues. Mélangez par inversion et centrifugez brièvement de manière à ce que les billes restent dispersées. Incubez pendant 5 à 10 minutes. Séparez les billes sur un support magnétique. Jetez le surnageant. Effectuez une étape de lavage avec 500 μl d'éthanol à 70 % en laissant le tube sur le support magnétique. Jetez le surnageant. Répétez l'étape de lavage. Centrifugez brièvement et séparez l'éthanol au fond du tube des billes en utilisant un support magnétique, puis retirez-le complètement. Laissez sécher la pellicule à l'air pendant 2 minutes. Éluez avec 150 μl d'eau et centrifugez brièvement. Incubez pendant 5 minutes. Séparez les billes en utilisant le support magnétique.
5. Vérifiez la concentration d'ADN.

Préparation de la bibliothèque

1. Préparez la réaction de réparation des extrémités de l'ADN/ajout de dA selon les directives du fabricant.
2. Inactivation de la réaction de réparation des extrémités de l'ADN/dA-tailing par la chaleur, puis centrifugez brièvement et transférez 100 μl dans un tube de 1,5 ml. Ajoutez 60 μl de billes SPRIselect à 0,6× pour la purification à la réaction de réparation des extrémités de l'ADN/dA-tailing.
3. Quantifiez la récupération par fluorescence. Assurez-vous de récupérer entre 700 ng et 1 μg d'ADN.
4. Mélangez 22,5 μl du pool d'amplicons éludés avec 2,5 μl d'adaptateurs 1D (kit ONT) et 25 μl de Blunt/TA Ligase Master Mix et incubez pendant 10 minutes. Utilisez de l'eau pour atteindre un volume total de 100 μl, puis ajoutez 60 μl de billes SPRIselect (0,6×).
5. Éluer avec 46 μl d'eau. Incuber pendant 5 minutes. Utiliser le support magnétique pour la séparation et transférer le surnageant dans un tube frais.
6. Ajoutez 5 μl de BAM (kit ONT) et 50 μl de Master Mix de ligase Blunt/TA, puis incubez pendant 10 minutes.
7. Purifiez en ajoutant 60 μl (0,6×) de billes SPRIselect. Incubez pendant 5 à 10 minutes avant la séparation. Jetez le surnageant. Lavez avec 140 μl de tampon "Adapter Bead Binding" (kit ONT). Jetez le surnageant. Répétez l'étape de lavage avec 140 μl de tampon "Adapter Bead Binding".
8. Laissez sécher la pellet à l'air pendant 2 minutes, puis éluez avec 15 μl de tampon d'élution (kit ONT). Incubez pendant 5 minutes et transférez le surnageant dans un tube frais après séparation.
9. Quantifiez la récupération par fluorescence. Assurez-vous d'une récupération de plus de 250 ng d'ADN. La bibliothèque est maintenant prête pour le séquençage et doit être conservée sur glace.

Contrôle de qualité de la cellule de flux, amorçage et séquençage

1. Placez la cellule de flux dans un MinION MK1B et connectez le MinION à l'ordinateur sur lequel l'interface MinKNOW est installée.
2. Étiquetez votre expérience dans l'interface MinKNOW, par exemple, ID d'échantillon et ID de cellule de flux, puis appuyez sur le bouton "Soumettre". Sélectionnez le script de contrôle de qualité (QC) de la plateforme sous "Choisir une opération" et appuyez sur le bouton "Exécuter". Lorsque la vérification est terminée, le logiciel reviendra à la page de départ. Pour voir le rapport des pores actifs, cliquez sur le "panneau de notification". Le nombre de pores actifs devrait être supérieur à 800.
3. Inspectez la cellule d'écoulement pour détecter des bulles d'air dans le canal entre le port de amorçage et l'array. Pour éliminer les bulles d'air, ouvrez le "Port de Amorçage" et aspirez le tampon et les bulles ; en retirant le tampon, assurez-vous que l'array de capteurs est toujours recouvert de tampon.
4. Mélangez 480 μl de tampon de course (RBF) (kit ONT) avec 520 μl d'eau. Ajoutez 800 μl de la solution de préparation fraîchement préparée dans le "Port de préparation". Fermez le "Port de préparation" et attendez 5 minutes. Ouvrez le "Port d'échantillon SpotON" et ajoutez 200 μl dans le "Port de préparation". Ne laissez pas entrer de bulles d'air lors de la pipetage.
5. Dans un tube frais, mélangez 35 μl de tampon de course (RBF), 25,5 μl de billes de chargement, 2,5 μl d'eau et 12 μl de la bibliothèque de séquençage. Ajoutez goutte à goutte 75 μl de ce mélange dans le "Port d'échantillon SpotOn." Remettez le couvercle du port d'échantillon SpotON et fermez le port de amorçage. Fermez le couvercle du MinION.
6. Sélectionnez le script de protocole approprié sous "Choisir l'opération" et lancez le séquençage en appuyant sur le bouton "Exécuter". L'interface graphique vous tiendra informé de l'avancement du séquençage ; le temps nécessaire pour le séquençage dépendant du protocole de séquençage choisi.

Extraction et démultiplexage FASTQ

1. Créez un répertoire pour stocker les fichiers FASTQ.
2. Exécuter l'albacore.
3. Téléchargez les scripts de démultiplexage et copiez le fichier FASTQ nouvellement créé dans le même répertoire.
4. Rendez le script d'enveloppe exécutable.
5. Exécutez la routine de démultiplexage.

Génotypage

1. Ouvrez NGSengine.
2. Ouvrez un "Nouveau projet" via le bouton de fichier dans le coin supérieur gauche.
3. Définissez un nom pour votre projet, puis appuyez sur "Suivant".
4. Ajoutez le dossier pour stocker les fichiers fastq démultiplexés, puis cliquez sur "Suivant".
5. Un résumé est affiché, appuyez sur "Suivant" pour voir un aperçu des données pour une analyse plus approfondie.
6. Ouvrez "Préférences" via l'onglet Fichier dans le coin supérieur gauche :
   (a) Dans la section "Général", définissez le nombre maximum de lectures à 10 000, et choisissez "Oxford Nanopore" comme plateforme de séquençage.
   (b) Dans la section "Paramètres par défaut de Locus", définissez "Amplicon" sur "Auto" et "Région d'analyse" sur "Amplicon". Excluez les segments problématiques, tels que les homopolymères, en les excluant dans le champ "Ignorer les régions" après l'avoir défini sur "Personnalisé". Utilisez l'IPD-IMGT/HLA système de coordonnées génomiques pour définir les régions.
   (c) Dans la section "Sélection des loci", définissez les loci qui ont été inclus dans le séquençage. Placez-les dans la colonne "Analyse".
7. Définissez les loci en maintenant la souris sur l'échantillon à analyser ; en cliquant avec le bouton droit de la souris, définissez le locus/loci HLA qui doivent être typés.
8. Appuyez sur "Analyser" pour tous les échantillons sur le côté gauche de l'écran ou pour un échantillon spécifique sur le côté droit à la fin de la ligne de l'échantillon.
9. Lorsque l'analyse des données est terminée, un aperçu des allèles génotypés pour les échantillons est présenté.

Conclusion

Utilisation Séquençage par nanopores pour la longueur totale Génotypage HLA offre un examen robuste et méticuleux des gènes HLA. En générant des séquences allongées qui couvrent l'ensemble du spectre des séquences génétiques, des exons aux introns en passant par les composants régulateurs, cette approche affine considérablement la précision de Typage HLACe niveau de précision revêt une importance capitale pour faciliter l'appariement des donneurs d'organes et de moelle osseuse avec les receveurs, éclairer les bases génétiques des maladies auto-immunes et infectieuses, et orienter la conception sur mesure des interventions thérapeutiques dans les domaines de l'immunothérapie et du développement de vaccins.

Référence :

1. Lang K, Surendranath V, Quenzel P, et al. Génotypage complet des HLA de classe I avec le séquenceur à nanopores MinION // Typage HLA. Humana Press, New York, NY, 2018 : 155-162.