Extraction de l'ADN et de l'ARN pour le protocole de séquençage du métagénome et du métatranscriptome

Extraction simultanée d'ADN et d'ARN à partir d'échantillons

Co-extraction de l'ADN et de l'ARN

Pour chaque extraction, 3 tubes Greiner de 50 mL et 4 tubes Greiner de 15 mL sont nécessaires et doivent être étiquetés avec soin.
Placez 2 g de chaque taille (2 et 3 mm) de billes de verre fraîches et stériles dans chaque tube Greiner de 50 mL frais.
3. Pour préparer le mélange d'extraction pour une extraction, mélangez 7,5 mL de tampon d'extraction avec 0,2 mL de solution SLS à 20 %. Calculez toujours un surplus d'un échantillon supplémentaire pour les mélanges maîtres.
4. Préparez un tampon de phénol saturé et ajoutez 10 mg de 8-hydroxyquinoline par 10 mL de Roti®-Aqua-Phénol.
5. Utilisez des ciseaux et des pincettes stériles pour couper le sandwich de filtre congelé en petits morceaux. Placez les morceaux de filtre dans le tube Greiner.
Ajoutez 5 mL du mélange d'extraction.
Ajoutez 5 mL de phénol saturé en tampon.
8. Vibrer le mélange à 4 m/s pendant 60. Centrifuger pendant 20 minutes à 2000× g à 4 °C. Pendant la centrifugation, le mélange se sépare en une phase phénolique inférieure avec des billes de verre, une interface et une phase aqueuse supérieure.
9. Transférez la phase aqueuse supérieure contenant l'ARN dans un nouveau tube Greiner de 15 mL et conservez-le sur glace.
Ajoutez 2 mL du mélange d'extraction et 2 mL de phénol saturé en tampon à la phase phénolique pour une extraction répétée de phénol.
11. Mélangez soigneusement en vortexant le tube bouché et centrifugez à nouveau pendant 20 minutes à 2000× g à 4 °C.
12. Transférez la phase aqueuse supérieure dans la phase aqueuse déjà collectée à l'étape 8. Le volume des phases aqueuses combinées est d'environ 5 mL. Conservez sur glace.
13. Pour l'isolement de l'ADN, ajoutez 5 mL de Tris-base à la phase phénolique et mélangez bien. Conservez à 4 °C pendant au moins 40 minutes mais pas plus de 3 heures.
14. Poursuivre avec l'isolement de l'ARN.

Isolation de l'ARN

Ajoutez 0,1 volumes de sodium acétate 3 M au tube Greiner contenant les phases aqueuses regroupées provenant de la procédure d'extraction et de séparation de phases.
Ajoutez 5 mL de chloroforme-alcool isoamyle.
3. Mélangez vigoureusement par vortexage et centrifugez pendant 10 minutes à 10 020× g et 4 °C pour séparer les phases.
4. Décongeler le glycogène (35 μg/mL) sur de la glace.
5. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube Greiner et répétez les étapes 2 et 3.
6. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube Greiner et ajoutez un volume de glycogène de 1/700.
7. Mélangez vigoureusement et ajoutez un volume d'isopropanol pour précipiter l'ARN.
8. Mélangez vigoureusement et incubez les échantillons à -20 °C pendant la nuit.
9. Poursuivre l'isolement de l'ADN.

Isolement de l'ADN

1. Poursuivez l'isolement de l'ADN en mélangeant vigoureusement le tube Greiner contenant l'ADN extrait et centrifugez pendant 15 minutes à 2000 × g et 4 °C.
2. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube Greiner.
3. Ajoutez 2 mL de Tris-base 1 M à la phase phénolique inférieure et répétez le mélange et la centrifugation pendant 15 minutes à 2000× g et 4 °C.
4. Transférez la phase aqueuse supérieure à la phase aqueuse déjà collectée à l'étape 2. Ajoutez 5 mL de chloroforme-alcool isoamyle au tube.
5. Mélangez par vortexage et centrifugez pendant 20 minutes à 10 000 × g et à 4 °C pour séparer les phases.
6. Transférez la phase supérieure dans un nouveau tube Greiner et répétez les étapes 4 et 5.
7. Ajouter 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M et 1/700 volume de glycogène.
8. Mélangez vigoureusement. Ajoutez 2,5 volumes d'éthanol pur glacé pour précipiter l'ADN.
9. Mélangez vigoureusement et incubez les échantillons à -20 °C pendant la nuit.

Lavage et resuspension de l'ARN et de l'ADN

1. Pélletez les acides nucléiques précipités par centrifugation à la vitesse maximale pendant 30 minutes à 4 °C.
2. Lavez les pellets deux fois avec 1 mL d'éthanol à 80 % glacé. Centrifugez à la vitesse maximale pendant 15 minutes à 4 °C.
3. Séchez le pellet pendant environ 10 minutes à température ambiante et dissolvez l'ADN ou l'ARN dans 200 μL de tampon TE 1×.

Purification de l'ADN et de l'ARN

Élimination de l'ARN résiduel des échantillons d'ADN

Ajoutez 1 μL de RNase A à l'ADN extrait.
2. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
3. Purifiez l'ADN en utilisant le kit de sélection de taille Gene Read.
4. Éluate l'ADN avec 2× 25 μL d'eau traitée par DEPC préchauffée.

Purification de l'ARN

Ajoutez 700 μL de tampon RLT et 7 μL de ß-ME. Mélangez bien.
2. Ajoutez 500 μL d'éthanol à 96–100 % à l'ARN dilué. Mélangez bien. Ne centrifugez pas. Procédez immédiatement.
3. Transférez 700 μL d'échantillon dans une colonne de centrifugation RNeasy Mini placée dans un tube de collecte de 2 mL. Fermez doucement le couvercle et centrifugez pendant 15 secondes à 10 020 ×g. Jetez le filtrat.
4. Répétez l'étape 3 une fois.
5. Placez la colonne de centrifugation RNeasy Mini dans un nouveau tube de collecte de 2 mL.
Ajoutez 500 μL de tampon RPE à la colonne d'ultracentrifugation.
7. Fermez doucement le couvercle et centrifugez pendant 15 s à >10 020× g. Jetez le liquide de passage.
Ajoutez 500 μL d'éthanol à 80 % à la colonne de centrifugation RNeasy Mini. Fermez délicatement le couvercle et centrifugez pendant 2 minutes à 10 020 × g.
9. Placez la colonne de centrifugation RNeasy Mini dans un nouveau tube de collecte de 2 mL. Ouvrez le couvercle de la colonne de centrifugation et centrifugez à pleine vitesse pendant 5 minutes. Jetez le liquide de passage et le tube de collecte.
10. Placez la colonne de centrifugation RNeasy Mini dans un nouveau tube de collecte de 1,5 mL. Éluiez l'ARN deux fois avec 50 μL d'H2O traitée par DEPC.₂O (~95 μL d'éluate) pendant 1 min à pleine vitesse à 4 °C.
11. Mélangez 5 μL d'ARN purifié avec 5 μL de colorant de chargement d'ARN 2× et vérifiez le succès de l'extraction et de la purification de l'ARN en effectuant une électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %.

Digestion de l'ADN

1. Si la concentration de la solution d'acides nucléiques est supérieure à 200 ng/μL, diluez avec de l'eau traitée par DEPC.
Ajoutez 1/10 du volume de tampon DNase TURBO 10× (fourni) à l'échantillon d'ARN.
3. Ajouter 1/40 du volume d'inhibiteur d'ARNase RiboLock (concentration finale 1 U/μL).
Ajoutez 1 μL de TURBO DNase (2 U) par 10 μg d'ARN.
5. Incuber à 37 °C pendant 30 minutes.
Ajoutez 0,1 volumes de réactif d'inactivation de DNase et mélangez bien.
7. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Mélanger de temps en temps.
8. Centrifugez à 10 000 × g pendant 1,5 min et transférez l'ARN dans un tube frais.
9. Effectuer une PCR de contrôle du 16S rRNA. Répétez les étapes 3 à 8 si nécessaire.
10. Purifiez l'ARN avec le kit RNeasy MinElute comme recommandé.
11. Éluatez l'ARN dans 24 μL d'eau traitée par DEPC.

Contrôle PCR pour l'ADN résiduel

1. Combinez les ingrédients suivants dans un tube PCR stérile et sans ADN de 0,2 mL : 0,25 μL de tampon Phusion HF 5×, 0,5 μL de mélange de dNTP (10 mM chacun), 0,75 μL de MgCl 25 mM.₂et 0,25 μL de polymérase ADN HighFidelity Phusion (2 U/μL). Complétez jusqu'à un volume final de 24 μL avec de l'eau stérile sans RNase.₂O.
Ajoutez 1 μL d'ARN traité par DNase au mélange.
3. Effectuez des contrôles négatifs en utilisant le mélange de réaction sans modèle et des contrôles positifs en utilisant l'ADN d'E. coli DH5alpha.
4. Utilisez le schéma de cyclage thermique suivant : dénaturation initiale à 98 °C pendant 30 s, 25 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 10 s, d'hybridation à 62 °C pendant 30 s, suivis d'une extension à 72 °C pendant 30 s. Extension finale à 72 °C pendant 5 min.
5. Contrôlez le succès de la digestion de l'ADN en chargeant 5 μL de la réaction PCR sur un gel d'agarose à 2 %.

Synthèse de la première et de la deuxième brin

1. Mélangez 8 μL d'ARN pur avec 1 μL d'amorce inverse (20 μM) sans adaptateur MiSeq de l'amplicon souhaité, 1 μL de dNTPs (10 mM chacun) et 3 μL d'eau stérile sans RNase.
2. Incuber à 65 °C pendant 5 minutes.
3. Refroidir rapidement sur glace pendant au moins 1 minute.
4. Ajoutez dans l'ordre suivant : 4 μL de tampon de réaction 5×, 1 μL de DTT 0,1 M, 1 μL d'inhibiteur RiboLock et 1 μL de SuperScript™ III RT (200E).
5. Vortexez doucement et collectez la réaction par centrifugation brève.
6. Incuber à 55 °C pendant 1 h.
Incuber à 70 °C pendant 15 minutes.
Ajoutez 0,5 μL d'ARNase H (5 U/μL).
Incuber pendant 15 minutes à 37 °C.
Incuber pendant 10 minutes à 65 °C.
11. Procédez à la PCR de l'amplicon souhaité en utilisant 1 μL de cDNA généré ou conservez les échantillons à -20 °C jusqu'à une utilisation ultérieure.