Protocole d'extraction et de validation des microARN extracellulaires

Collecte de fluides corporels

1. Collectez et traitez les échantillons de la même manière tout au long de l'étude. En cas de maladies spécifiques au genre ou de cohortes d'un seul genre, utilisez les échantillons de contrôle du même genre. Si un appariement par âge est possible, utilisez les échantillons de patients du même âge ou d'un âge similaire.
2. Utilisez de préférence les tubes de stabilisation ou d'autres produits chimiques de stabilisation pour la collecte d'échantillons afin d'arrêter l'activité des RNases dans les échantillons. La collecte d'échantillons dans des tubes de stabilisation doit être effectuée aussi rapidement que possible.
3. Collectez les échantillons dans la même plage horaire de la journée, de préférence le matin. Utilisez l'urine du deuxième matin, fraîchement évacuée. Évitez d'utiliser l'urine du premier matin.
4. Les échantillons préopératoires/diagnostiques doivent être collectés avant la chirurgie (et l'application d'un traitement). Il faut tenir compte du fait que tous les médicaments administrés aux patients au cours de l'échantillonnage peuvent affecter les résultats.
5. Conservez les échantillons collectés dans des tubes de stabilisation soit à température ambiante, soit entre 6 °C et 12 °C (de préférence) pendant une durée maximale d'un mois avant un traitement ultérieur. Ne pas congeler.
6. En cas d'autres techniques de collecte, notamment sans réactifs de stabilisation, un traitement immédiat de l'échantillon (centrifugations et isolement de l'ARN et stockage à -80 °C) doit être appliqué.

Séparation de la fraction extracellulaire

1. Appliquez deux centrifugations consécutives, à 430 × g (ou jusqu'à 1000 × g) pendant 20 minutes à température ambiante et à 2000 × g (ou jusqu'à 2500 × g) pendant 10 minutes à 4 °C. Évitez d'utiliser des forces de centrifugation plus fortes car cela peut éliminer une certaine proportion d'exosomes ou d'autres vésicules transportant des miARN. Cette étape de deux centrifugations est nécessaire pour éliminer les cellules et les plaquettes (sang, ascite), ou les précipités potentiels et la contamination par des débris cellulaires/bactériens (urine).
2. Transférez les fractions extracellulaires (supernatants) dans des tubes propres pour PCR, congelez et conservez les échantillons à -25 °C à court terme ou à -80 °C à long terme.
3. Inspectez l'hémolyse dans les échantillons de plasma/ascite, car cela se produit souvent dans les échantillons de cancer ou en cas de prélèvement sanguin suboptimal. Les échantillons hémolytiques doivent être évités (ou traités séparément) car les miARN dérivés des érythrocytes peuvent affecter les résultats. Cela s'applique également dans le cas où les échantillons d'urine contiennent des globules rouges et qu'une hémolyse a eu lieu.

Isolation de l'ARN total

1. Utilisez des aliquotes d'échantillons congelés idéalement d'un volume identique, par exemple, 2 mL, et décongelez-les à température ambiante. Ne retirez pas les éventuels précipités dans les échantillons d'urine après décongélation, car ils peuvent contenir des miARN liés à des protéines. Cependant, ne utilisez pas les débris rouges au fond du tube dans les échantillons de plasma.
2. Procédez à l'isolement de l'ARN total.
3. Utilisez le Maxi Kit de purification d'ARN circulant et exosomal à partir de plasma/sérum pour l'isolement d'ARN à partir de plasma et le Maxi Kit de purification d'ARN total à partir d'urine (format slurry) pour l'isolement d'ARN à partir d'urine. Alternativement, utilisez l'un des kits disponibles dans le commerce pour l'isolement d'ARN total en veillant à l'isolement des petits ARN. Conservez l'ARN total isolé (et aliquoté) à -80 °C.

Validation des miARN individuels

1. Effectuez une transcription inverse de l'ARN total en cDNA en utilisant le TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit et des amorces spécifiques en boucle pour miARN. Au lieu de réactions à grande échelle, des réactions réduites jusqu'à un tiers ou la moitié des volumes d'entrée originaux recommandés pour tous les réactifs et l'ARN peuvent être utilisées. De plus, une quantité accrue d'ARN peut être appliquée en remplaçant le ddH.₂Le volume, afin d'améliorer les valeurs Ct résultantes dans des échantillons à faible concentration d'ARN. Utilisez le même volume d'ARN d'entrée pour tous les échantillons de l'expérience.
2. Préparez le mélange de réaction sur glace. Dans les réactions réduites (7,5 μL), chaque réaction doit comprendre 2,08 μL d'eau sans nucléase (ddH₂O), 0,75 μL de tampon de transcription inverse 10×, 0,095 μL d'inhibiteur d'ARNase (20 U/μL), 0,075 μL de dNTPs à 100 mM avec dTTP, et 0,5 μL de transcriptase inverse MultiScribe (50 U/μL), préparés en grande quantité sous forme de mélange maître. Pour chaque mélange maître spécifique à un miARN, ajoutez 1,5 μL de l'amorce RT (5×) et enfin ajoutez 2,5 μL d'échantillon d'ARN spécifique pour chaque réaction. Mélangez doucement par inversion (ne pas vortexer) et centrifugez brièvement.
3. Dans un cycler thermique, effectuez la réaction de transcription inverse dans des tubes PCR de 0,2 mL en suivant les conditions suivantes : 16 °C pendant 30 min, 42 °C pendant 30 min, et 85 °C pendant 5 min. Maintenir à 4 °C. Le produit de RT (cDNA) peut être conservé à -25 °C pendant au moins 2 semaines avant le qPCR.
4. Utilisez des plaques PCR à 96 puits selon le cycler qPCR, trois puits par échantillon, c'est-à-dire un échantillon en triplicat.
5. Combinez les échantillons des groupes comparés (par exemple, cancer vs témoins) sur une seule plaque lorsque cela est possible, idéalement pour les miARN étudiés et également les contrôles endogènes nécessaires à la normalisation.
6. Des contrôles sans modèle (uniquement un mélange maître avec des amorces spécifiques sans cDNA) doivent être inclus.
7. Réalisez des réactions de qPCR à échelle réduite (10 μL). Préparez un mélange de réaction comprenant le TaqMan Universal PCR Master Mix (2×) ou le Xceed qPCR Probe 2× Mix HI-ROX buffer (5 μL), de l'eau sans nucléase (3,8 μL) et un essai d'ARN petit spécifique à l'ARNm (20×) (0,5 μL) (les volumes sont par réaction ; trois réactions doivent être effectuées par échantillon), en incluant des volumes excédentaires (15 %) pour compenser les pertes lors de la pipetage.
8. Préparez un prémélange de réactions aliquotées dans des tubes pour des réactions en triplicat (c'est-à-dire 32 μL avec une réserve) ; Ajoutez le produit cDNA (7,5 μL) de la transcription inverse pour chaque échantillon en pipetant doucement. Centrifugez brièvement.
9. Aliquote 10 μL de prémélange avec cDNA en triplicates pour chaque échantillon dans la plaque de réaction MicroAmp Optical à 96 puits et scellez-la. En cas d'utilisation du Bio-Rad CFX Connect, utilisez des plaques PCR à 96 puits, non bordées, et le film de scellement PCR Microseal 'B'.
10. Centrifugez la plaque (par exemple, à 700 × g à 1300 × g) en utilisant une centrifugeuse et un rotor appropriés (par exemple, Eppendorf 5430) pendant 1,5 à 3 minutes.
11. Exécutez des réactions de PCR en temps réel à l'aide d'un thermocycleur qPCR (par exemple, 7900HT Fast Real-Time PCR System ou Bio-Rad CFX Connect). Utilisez les paramètres de thermocycleur suivants : 50 °C pendant 2 min et 95 °C pendant 10 min. Pour 40 cycles, utilisez les paramètres suivants : 95 °C pendant 15 sec et 60 °C pendant 1 min (ou 30 sec en mode rapide).