Techniques actuelles pour l'enrichissement ciblé des régions

Qu'est-ce que le séquençage de région ciblée ?

Alors que séquençage du génome entier couvre l'ensemble du génome d'un organisme, séquençage de région ciblée détermine l'ordre des nucléotides dans les régions d'intérêt. En utilisant le séquençage génomique ciblé, vous pouvez détecter des SNP, des indels, des CNV et des SV de grande taille de manière hautement sensible et spécifique. Comparé au séquençage du génome entier, le séquençage génomique ciblé est plus ciblé, économique et efficace. De plus, les régions ciblées peuvent être séquencées à une profondeur beaucoup plus grande pour un coût inférieur, ce qui contribue à détecter des variations rares. Le séquençage de l'exome entier est un exemple de séquençage génomique ciblé puisqu'il se concentre sur les exons. Et en utilisant un panel ciblé ou de "points chauds", nous pouvons séquencer un ensemble de gènes d'intérêt. Ces gènes peuvent abriter des mutations associées à la pathogénie des maladies, ou ces gènes sont des gènes d'intérêt cliniquement exploitables. Cela a été appliqué à la recherche biologique et médicale, ainsi qu'aux soins cliniques. Ici, nous discutons principalement des techniques actuelles d'enrichissement ciblé et recommandons des produits qualifiés.

Techniques classiques pour l'enrichissement ciblé

L'enrichissement ciblé facilite grandement le développement du séquençage de régions ciblées, rendant le séquençage abordable et efficace pour les génomes complexes. Il existe trois stratégies classiques pour l'enrichissement ciblé (Figure 1).

Figure 1. Stratégies pour l'enrichissement ciblé (Mertes) et al.. 2011). 1) Capture hybride soit sur des microarrays (a) soit en solution (b). 2) Enrichissement par MIPs (a), ou sondes sélectrices (b). 3) Enrichissement par PCR classique (a), essai PCR multiplex (b), et PCR par micro goutte RainDance avec jusqu'à 20 000 paires d'amorces (c).

• Capture hybride

La bibliothèque de fragments de fusil de chasse est préparée pour s'hybrider à une bibliothèque contenant des fragments d'ADN complémentaires aux régions cibles. Cela peut être réalisé sur des microarrays ou dans des solutions. Mamanova et al.(2010) a constaté que pour des tailles de cibles petites (environ 3,5 Mb), la capture en solution offre une couverture supérieure des régions cibles par rapport à l'approche basée sur les puces, et que pour l'enrichissement de l'exome entier, les deux approches sont équivalentes. Nous recommandons SureSelect (Agilent Technologies), Nextera (Illumina), TruSeq (Illumina) et SeqCap EZ (Roche NimbleGen) pour l'enrichissement des cibles basé sur l'hybridation en solution.

• Circularisation sélective

Les sondes d'inversion moléculaire (MIPs) se composent d'une séquence commune flanquée de séquences spécifiques à la cible. Après l'hybridation aux régions d'intérêt, le MIP est soumis à une réaction de remplissage de lacunes et à une ligation pour générer des cercles fermés. Les MIPs peuvent être hybridisés à de l'ADN mécaniquement déchiqueté, tandis que les sondes sélectrices utilisent un cocktail d'enzymes de restriction pour digérer l'ADN et les sondes sont adaptées au schéma de restriction. Les MIPs et les sélecteurs se composent d'un lien central commun, le primer de séquençage pour le NGS pouvant être inclus dans ce lien. Par conséquent, la construction de la bibliothèque NGS n'est pas nécessaire. Nous recommandons HaloPlex (Agilent Technologies) pour l'enrichissement ciblé basé sur la circularisation sélective.

• Amplification par PCR

La PCR est utilisée pour enrichir des régions d'intérêt en réalisant plusieurs PCR à longue portée en parallèle, des PCR multiplex et des PCR en microgouttelettes. Il existe de nombreux produits disponibles pour la PCR à longue portée, y compris SequalPrep (Thermo Fisher Scientific) et SeqTarget (Qiagen), Ion Ampliseq basé sur la PCR à haut multiplexage, et la technologie des microgouttelettes de RainDance.

Les comparaisons des techniques d'enrichissement ciblé classiques

Les quatre stratégies ont leurs propres mérites et inconvénients. Par exemple, la spécificité de la PCR dépasse celle de la capture hybride, mais son uniformité n'est égalée ni par les MIPs ni par la capture hybride. Pour des mises à jour des protocoles, vous pouvez visiter ce site web : ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pulldown/.

Tableau 1. Comparaisons des méthodes d'enrichissement ciblé. Adapté de Dapprich et al.. (2016).

Méthode avancée : Extraction spécifique à la région (ESR)

Les méthodes traditionnelles reposent fortement sur la fragmentation de l'ADN avant l'amplification, ce qui génère des séquences relativement courtes (moins de 1 kb). Cela constitue un facteur limitant pour la caractérisation de loci génomiques complexes, car elles ne peuvent pas fournir des fragments suffisamment grands pour couvrir des éléments de séquence confondants. Heureusement, la méthode d'enrichissement — Extraction Spécifique à une Région (RSE), proposée par Dapprich et al.. (2016) répond à ce besoin non satisfait en capturant de longs fragments d'ADN (environ 20 kb).

Le principe de la RSE est décrit dans la Figure 2. En résumé, l'ADN génomique est dénaturé pour être hybridé avec des amorces de capture. Les amorces fixées sont ensuite étendues enzymatiquement avec des dNTPs biotinylés incorporés. Les segments d'ADN ciblés sont récupérés par des particules magnétiques recouvertes de streptavidine. L'ADN capturé peut être amplifié par amplification du génome entier et ensuite traité par séquençage de nouvelle génération.

Figure 2. Principe de RSE.

Métriques pour l'évaluation d'une expérience d'enrichissement ciblé

Il existe plusieurs métriques à prendre en compte dans les expériences d'enrichissement ciblé. Pour traiter ce problème, un ensemble universel de Descripteurs de Séquençage d'Enrichissement Ciblé (DSEC) a été développé, permettant d'évaluer les résultats de l'enrichissement ciblé. Le DSEC utilise les paramètres suivants :

1. Région d'intérêt, ROI
2. Profondeur de lecture moyenne dans la région de lecture, D_ROI
3. Spécificité, S
4. Facteur d'enrichissement, FE
5. Égalité, E
6. Poids de l'ADN d'entrée requis, W
7. Fraction suffisamment couverte à une profondeur de lecture de x, F_x

Parmi les sept indicateurs, le ROI et W déterminent les besoins en entrée, et les cinq autres constituent un rapport mesurable soit sur l'enrichissement (S, EF, E) soit sur les résultats de séquençage (D)._ROI, F_x).

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Références :

1. Dapprich J, Ferriola D, Mackiewicz K, et al.La prochaine génération de technologies de capture de cibles - l'enrichissement et le séquençage de grands fragments d'ADN détermine la variation génomique régionale de haute complexité. BMC génomique, 2016, 17(1) : 486.
2. Mamanova L, Coffey A J, Scott C E, et al.Stratégies d'enrichissement ciblé pour le séquençage de nouvelle génération. Méthodes de la nature, 2010, 7(2) : 111.
3. Mertes F, ElSharawy A, Sauer S, et al.Enrichissement ciblé des régions d'ADN génomique pour le séquençage de nouvelle génération. Briefings en génomique fonctionnelle, 2011, 10(6) : 374-386.
4. McGinn S, Bauer D, Brefort T, et al.Nouvelles technologies pour l'analyse de l'ADN – une revue du projet READNA. Nouvelle biotechnologie, 2016, 33(3) : 311-330.
5. Ballester, L. Y., Luthra, R., Kanagal-Shamanna, R., et al. Avancées dans le séquençage de nouvelle génération clinique : enrichissement ciblé et technologies de séquençage. Revue experte des diagnostics moléculaires, 2016, 16(3), 357–372. doi:10.1586/14737159.2016.1133298