Dépistage et séquençage CRISPR : Introduction, flux de travail et applications

En compétition avec les bactériophages, les bactéries et les archées ont évolué des moyens uniques de défense, qui incluent les systèmes CRISPR/Cas, les systèmes immunitaires des bactéries et des archées pour résister à l'invasion d'ADN ou d'ARN étrangers, reconnaître les acides nucléiques envahissants étrangers et les cliver pour la défense immunitaire.

Actuellement, les systèmes CRISPR/Cas sont devenus des outils de recherche efficaces et pratiques largement utilisés dans le domaine du génie génétique. Par exemple, dans un processus d'édition génique induit par CRISPR/Cas9, l'enzyme Cas9 clive spécifiquement l'ADN double brin avec l'aide de l'sgRNA (ARN guide court). Et la cellule réalise l'édition du gène cible par jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) ou réparation dirigée par homologie (HDR).

Pendant ce temps, les systèmes CRISPR/Cas peuvent être facilement adaptés à un criblage à l'échelle du génome. Dépistage CRISPR est une approche de criblage génétique à grande échelle qui génère et dépiste une population de cellules mutantes pour faciliter la découverte de gènes clés ou de séquences génétiques dans un type cellulaire particulier. L'idée de base du criblage CRISPR est de désactiver chaque gène du génome qui pourrait être important, un gène par cellule.

Le flux de travail du criblage et du séquençage par knockout CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome.

1. Construction de la bibliothèque de sgRNA : les sgRNA sont conçus par ordinateur, synthétisés, amplifiés par PCR et clonés dans un système de vecteur de livraison.

2. Criblage : Introduire la bibliothèque de sgRNA, Cas9 et d'autres composants nécessaires dans les cellules. Ensuite, les clones souhaités sont sélectionnés et l'ADN est extrait.

3. Séquençage : PCR et séquençage de nouvelle génération.

4. Mesure et Analyse : les sgARN sont récupérés, analysés et les gènes associés identifiés.

Applications du criblage et du séquençage CRISPR

Pour identifier des gènes liés aux maladiesLe criblage CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome peut être utilisé pour identifier des gènes liés aux maladies, ce qui est important pour la découverte de nouvelles cibles médicamenteuses et fournit des stratégies de traitement. Par exemple, les technologies de criblage CRISPR/Cas9 sont un atout pour la thérapie du cancer : des gènes cibles peuvent être obtenus et analysés pour trouver des gènes avec une corrélation plus élevée de la capacité de survie des cellules tumorales. En supprimant l'expression de ces gènes, le cycle cellulaire tumoral est bloqué et l'apoptose est induite, tandis que les cellules sanguines normales sont moins affectées. Le criblage CRISPR/Cas9 peut également être utilisé pour étudier des gènes liés à la métastase, pour explorer comment les virus envahissent et blessent les cellules hôtes, et plus encore.

Étudier les séquences non codantesLes séquences d'ADN non codantes, composant environ 98 % de la séquence du génome humain, incluent l'ARN non codant, les éléments régulateurs cis et trans, les introns, les pseudogènes, les télomères, les séquences répétitives, etc. Des études ont montré que les séquences non codantes jouent un rôle essentiel dans la régulation de l'expression génique, la tumorigénèse, la régulation immunitaire, l'ontogenèse et de nombreux autres processus biologiques. Le criblage CRISPR à l'échelle du génome peut être appliqué pour étudier des séquences d'ADN non codantes inconnues qui sont d'une grande importance pour comprendre la régulation génique, les maladies et l'évolution biologique.

Étudier les réseaux de régulationLe criblage génomique CRISPR/Cas9 a été largement appliqué dans divers domaines de la biologie cellulaire. Cependant, le criblage des phénotypes se pratique principalement dans la prolifération cellulaire, la viabilité, la résistance aux médicaments et l'expression des gènes rapporteurs, etc. Des réseaux régulateurs biologiques plus complexes (tels que le transcriptome, l'interaction des gènes) au sein des cellules nécessitent des recherches supplémentaires. En combinant la technologie de criblage génomique CRISPR/Cas9 et le séquençage à cellule unique, l'expression de l'sgRNA peut être capturée avec précision, et les changements du niveau de transcription des gènes dans les cellules peuvent être mesurés. Dans le même temps, une grande quantité de données peut être analysée selon le modèle computationnel, et le réseau complexe de gènes peut être décrit.