Protocole de séquençage de criblage CRISPR

Isolation de l'ADN génomique

1. Nettoyez la station d'ADN génomique avec de l'eau de Javel à 10 %, suivie d'eau et enfin d'éthanol à 70 %. Préparez des aliquotes des solutions nécessaires du kit de purification d'ADN génomique Wizard. Préchauffez le tampon TE (solution de réhydratation) à 65 °C et préparez de l'éthanol à 70 % (pour les échantillons) en utilisant de l'eau UltraPure.
2. Décongelez les pellets cellulaires à température ambiante pendant 5 à 10 minutes.
3. Resuspendez les cellules dans 1 ml de PBS et transférez-les dans un tube à centrifuger de 50 ml. Rincez le tube d'origine avec 400 μl de PBS et ajoutez-le au même tube de 50 ml.
Ajoutez 5 ml de la solution de lyse des noyaux aux cellules resuspendues. Mélangez en pipetant avec une pipette de 10 ml (cinq fois).
5. Ajoutez 32 μl de RNase A (stock à 20 mg/ml ; concentration finale de 100 μg/ml) au lysat nucléaire et mélangez en inversant le tube cinq fois. Incubez à 37 °C pendant 15 minutes, puis laissez refroidir à température ambiante (~10 minutes).
Ajoutez 1670 μl de solution de précipitation de protéines au lysat nucléaire et vortexez vigoureusement pendant 20 secondes.
7. Centrifugez à 4500 × g pendant 10 minutes à température ambiante.
8. À l'aide d'une pipette de 10 ml, transférez le surnageant dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 5 ml d'isopropanol. Faites très attention à ne pas transférer de précipité.
9. Mélangez doucement la solution dix fois par inversion, jusqu'à ce que les filaments blancs de l'ADN forment une masse visible.
10. Centrifugez à 4500 × g pendant 5 minutes à température ambiante. L'ADN sera visible sous forme d'un petit pellet blanc.
11. Retirez soigneusement le surnageant, en évitant de déloger le culot. Ajoutez 5 ml d'éthanol à 70 % à l'ADN. Faites tourner doucement le tube pour laver le culot d'ADN et les parois du tube de centrifugation.
12. Centrifuger à 4500 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
13. Retirez soigneusement et complètement tout l'éthanol, en évitant de déloger le culot. Laissez sécher l'ADN génomique à l'air libre à température ambiante pendant 10 à 30 minutes jusqu'à ce que le culot apparaisse translucide. Ne pas trop sécher (avant l'apparition de fissures visibles). Évitez la contamination par des particules de poussière.
14. Ajoutez 400 μl de tampon TE (solution de réhydratation de l'ADN) et laissez l'ADN se dissoudre en incubant à 65 °C pendant 1 à 4 heures. Mélangez l'ADN en tapotant doucement le tube toutes les 15 minutes jusqu'à ce que le culot soit complètement dissous. La suspension peut être légèrement visqueuse mais ne doit pas contenir de grumeaux d'ADN.
Centrifugez à 4500 × g pendant 1 minute à température ambiante et transférez l'ADN génomique dans un tube de 1,5 ml à faible liaison.
16. Quantifiez l'ADN à l'aide d'un fluoromètre Qubit et conservez-le à −20 °C.

Préparation de la bibliothèque de séquençage

1. Incluez toujours l'échantillon T0 pour déterminer la représentation de la bibliothèque dans le criblage et permettre le calcul du changement de fold gRNA.
2. Nettoyez les postes de travail PCR1 et PCR2 avec une solution d'eau de Javel à 10 %, suivie d'eau et enfin d'éthanol à 70 %.
3. Préparez un gel d'agarose à 1 % contenant le colorant SYBR Safe pour vérifier les produits amplifiés par PCR1. PCR1 enrichit le cassette gRNA à partir du génome.
4. Dans la hotte PCR : mettez en place une réaction de diagnostic (ne pas ajouter d'ADN génomique pour l'instant) et un contrôle négatif sans modèle.
5. Vérifiez l'amplification PCR en chargeant 2 μl du produit PCR sur le gel d'agarose préparé. La taille attendue du produit est d'environ 600 pb.
6. Amplifiez les réactions PCR1 dans un thermocycleur en utilisant le programme.
7. Rendez-vous à la station de travail PCR2 et regroupez toutes les 14 + 1 (diagnostic) réactions PCR1 dans un tube microfuge de 1,5 ml.
8. Faites tremper l'équipement de gel d'agarose (bac à gel, peigne et cuve à gel) pour purifier les produits PCR2 amplifiés avec de l'HCl à 0,1 N pendant 10 minutes avant de couler le gel. Rincez 4 fois à l'eau du robinet et une fois avec de l'eau purifiée.
9. Préparez un gel d'agarose à 2 % contenant le colorant SYBR Safe pour purifier les produits amplifiés par PCR2. Utilisez de grands peignes et laissez suffisamment d'espace entre les échantillons. PCR2 amplifie le cassette gRNA et ajoute des adaptateurs Illumina TruSeq avec des indices i5 et i7.
10. Préparez les réactions PCR2 (ne pas ajouter encore le produit PCR1 comme modèle). Préparez des contrôles sans modèle selon vos besoins.
11. Exécutez la réaction PCR2 complète sur le gel d'agarose à 2 % préparé à basse tension (course de 1,5 à 2 heures). Visualisez le produit de PCR sur un transilluminateur à lumière bleue, la taille attendue du produit est d'environ 200 pb. Plusieurs bandes peuvent être visibles ; il est important de bien séparer les bandes.
12. Excisionnez la bande de 200 pb avec une nouvelle lame de rasoir et transférez la tranche de gel dans un tube de 1,5 ml.
13. Purifiez l'ADN à partir d'une tranche de gel d'agarose en utilisant un kit d'extraction de gel. Nous recommandons de répéter chaque étape de liaison deux fois et d'inclure des lavages intermittents avec le tampon de liaison si les volumes de liaison sont importants. Nous recommandons également une double élution pour maximiser le rendement.
14. Conservez l'ADN purifié par gel dans un tube à faible liaison de 1,5 ml.
15. Quantifiez l'ADN sur un fluoromètre Qubit.

Séquençage de nouvelle génération

1. En raison des différences dans les exigences de soumission d'échantillons et des contrôles de qualité appliqués par les installations et les fournisseurs de séquençage de nouvelle génération, nous ne fournissons que des recommandations générales dans cette section.
2. Les bibliothèques de séquençage peuvent désormais être regroupées. Le degré de multiplexage dépend de la profondeur de lecture souhaitée par échantillon. Pour les écrans de dropout, nous recommandons de lire chaque échantillon avec une couverture de bibliothèque de 200 fois et une couverture de 500 fois pour les échantillons T0 afin d'assurer la robustesse lors de l'analyse des données en raison de l'absence de répliques indépendantes à T0. Pour les écrans de sélection positive forte visant à identifier des gRNAs enrichis, une couverture de 50 fois peut être suffisante.
3. Séquençage sur Illumina HiSeq2500 ou NextSeq550 avec des amorces standard pour le double indexage.

Référence :

1. Mair B, Aregger M, Tong A H Y, et al. Une méthode pour cartographier l'essentiel des gènes des cellules souches pluripotentes humaines par des écrans CRISPR à l'échelle du génome avec Cas9 inductible[J]. Gènes et génomes essentiels : Méthodes et protocoles, 2022 : 1-27.