Protocole d'identification du coronavirus par séquençage métagénomique

Préparation d'échantillons

1. Regrouper les contenus intestinaux de pintades de Guinée infectées expérimentalement et resuspendre dans 500 μl de PBS avec de la pénicilline et de la streptomycine. Vortexer.
2. Filtrer (filtre de 0,45 μm) la solution pour éliminer les particules de la taille des cellules eucaryotes et bactériennes.
3. Centrifugez le contenu digestif à 10 000 × g pendant 30 minutes deux fois pour clarifier la solution et recueillez le surnageant dans un nouveau tube.

Concentration de Particules Virales

1. Pélletez le matériau concentré par ultracentrifugation à 100 000 × g pendant 2 h.
2. Traiter avec RNAse et DNAse pour éliminer les acides nucléiques non protégés par les particules : préparer un mélange de 500 μl d'échantillon, 10 μl de DNAse (100 U), 12 μl de RNAse (20 μg/μl), 60 μl de tampon DNAse 10×, 16 μl de PBS. Incuber le mélange pendant 20 minutes à 37 °C puis 10 minutes à 75 °C pour arrêter la réaction.

Extraction et amplification de l'ARN

Ajoutez 750 μl de TRIzol à 250 μl d'échantillon, étape 2, et incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
Ajoutez 200 μl de chloroforme, vortexez vigoureusement et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
Centrifuger pendant 15 minutes à 11 000 × g à 4 °C.
4. Récupérez la phase aqueuse supérieure.
5. Extraire l'ARN de 150 μl de la phase aqueuse collectée sur une colonne de silicate à l'aide d'un kit d'extraction d'ARN.
6. Effectuez une réaction de transcription inverse en utilisant des amorces aléatoires en mélangeant 7,5 μl d'ARN et 5 μl d'hexamères aléatoires marqués.
7. Incuber à 65 °C pendant 5 minutes puis conserver sur glace.
Ajoutez 4 μl de tampon de réaction 5×, 0,5 μl d'inhibiteur d'ARNase, 2 μl de dNTP et 1 μl de transcriptase inverse RevertAid.
9. Incuber à 25 °C pendant 10 min, à 42 °C pendant 60 min, et à 70 °C pendant 10 min.
10. Les réactions peuvent maintenant être stockées à −20 °C ou utilisées immédiatement pour la PCR.
11. Réalisez une PCR aléatoire en mélangeant 10 μl de tampon de réaction Phusion HF 5×, 1 μl de dNTP, 0,5 μl d'amorce uniquement pour le tag, 5 μl de cDNA, 0,5 μl de polymérase Phusion et 33 μl d'eau.
12. Effectuer une PCR en utilisant le cycle suivant : 98 °C pendant 30 s, suivi de 40 cycles de 98 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 30 s, suivi d'une incubation finale à 72 °C pendant 10 min.
13. Analyser les produits de PCR sur un gel d'agarose à 1 %, migrer pendant 1 h à 60 V.
14. Excision des bandes de 300 pb et purification par gel avec un kit commercial.
15. Évaluation de la qualité de la bibliothèque préparée : quantifier l'ADN généré par une méthode basée sur la fluorescence (essai de quantification PicoGreen®) et viser 1 μg d'ADN en entrée ; vérifier la qualité de l'ADN et viser un rapport 260:280 > 1,8.

Génération de clusters à l'aide du kit de réactifs Miseq (Illumina)

1. Hybridiser l'échantillon sur la cellule de flux.
2. Échantillon amplifié (amplification par pont).
3. Linéariser les fragments.
4. Bloquer les fragments.
5. Amorcer de séquençage hybride.

Séquençage sur le Miseq (Illumina)

1. Le fragment d'ADN de la bibliothèque agit comme un modèle, à partir duquel une brin complémentaire est synthétisé.
2. Les ddNTP sont ajoutés un par un (un cycle = un ddNTP ajouté, une image prise et défluoration du ddNTP pour pouvoir ajouter un nouveau ddNTP au cycle suivant) par une ADN polymérase. L'ajout de ddNTP est enregistré numériquement en tant que données de séquence cycle après cycle.

Analyse de données

1. Prétraitez les données pour supprimer les séquences d'adaptateurs et effectuer le démultiplexage à l'aide de splitbc (plusieurs échantillons peuvent être multiplexés et analysés ensemble sur le séquenceur MiSeq Illumina pour réduire les coûts).
2. Prétraiter les données pour éliminer les lectures de faible qualité et compiler les séquences appariées en utilisant illuminapairedend.
3. Mapper les données à un génome de référence ou aligner de novo les lectures de séquence (alignement avec bwa, consensus calculé avec le logiciel SAMtools. Afficher les résultats avec le navigateur IGV).
4. Analyser la séquence compilée avec le logiciel GAAS avec une valeur attendue de 10−3.