Protocole de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq)

Préparation de la suspension cellulaire et du lysat tissulaire

Trypsinisez les cellules adhérentes cultivées et suspendez-les dans du PBS. Alternativement, les cellules peuvent être raclées du récipient de culture après fixation. En général, 10⁶–10⁷ Les cellules sont utilisées pour un seul IP ; cependant, le nombre optimal de cellules varie en fonction de l'anticorps utilisé. Pour préparer des lysats tissulaires, congeler rapidement des sections de tissu fraîchement isolées (30–100 mg) dans de l'azote liquide, puis les homogénéiser dans du PBS à l'aide d'un homogénéisateur Dounce (1–2 mL) avec un piston lâche.

Fixation et fragmentation de la chromatine

Modifications des histones

Ajoutez 1/10 du volume de tampon de fixation à la suspension cellulaire ou au lysat tissulaire et incubez à 25℃ pendant 5 à 15 minutes avec un mélange ou une rotation douce.
2. Ajouter 1/10 du volume de glycine 1,5 M et incuber à 25℃ pendant 3 minutes avec un mélange doux ou une rotation.
3. Centrifuge et lavez deux fois avec du PBS.
4. Resuspendre le culot cellulaire dans le tampon de lyse et incuber sur glace pendant 15 minutes. Homogénéiser les cellules dix fois avec une seringue équipée d'une aiguille de 21 à 23G. Compter les noyaux à l'aide d'un hémocytomètre ou par coloration DAPI. Centrifuger les noyaux pendant 5 minutes à 4℃.
5. Resuspendre le culot dans le tampon de lyse SD à une densité de 1–2×10.⁶ noyaux/100μL, et incuber sur glace pendant 5 minutes.
6. Transférez la suspension de noyaux dans un tube Picoruptor (100–300 μL/tube). Conditions de sonication : 5–30 cycles (30 sec on/30 sec off) à 4℃.
7. Centrifugez le mélange à 13 000 ×g pendant 5 minutes, à 4℃, et collectez le surnageant pour les étapes d'IP suivantes.

Modificateurs d'histones

1. Réseau croisé dual : Avant le réseau croisé au formaldéhyde, suspendre les cellules/le lysat tissulaire dans 2 mM de DSG et incuber à 25℃ pendant 5 minutes.
2. Sonication : Suspendre les noyaux dans un tampon RIPA 1×, qui contient 0,1 % de SDS, au lieu du tampon de lyse SDS. Le temps optimal de sonication peut être plus long (jusqu'à 50 minutes) que celui de la méthode de liaison simple.

Immunoprécipitation

1. Préclaircir : Diluer la solution de chromatine fragmentée dix fois avec le tampon de dilution ChIP. Ajouter des Dynabeads Protéine A ou G à 20μL/mL et faire tourner à 4℃ pendant 1h. Placer le tube sur un support magnétique pendant 5 min et collecter le surnageant. À ce stade, la chromatine de 1–4×10⁶ les cellules seront solubilisées par 1 mL.
2. Anticorps : Conservez 10 % de l'échantillon pour la purification de l'ADN ultérieure. Ajoutez des anticorps spécifiques à la modification des histones ou au modificateur à 4–10 μg/mL. Un échantillon parallèle ajoutant une quantité équivalente d'IgG de contrôle doit être préparé. Faites tourner toute la nuit à 4℃.
3. Tirer les billes vers le bas : Ajouter 20 μL de Dynabeads Protéine A ou G et faire tourner à 4℃ pendant 2 à 3 heures.
4. Les billes doivent être lavées cinq fois avec un tampon RIPA (faible salinité), un tampon RIPA (haute salinité) et un tampon LiCl, et deux fois avec TE. Entre chaque lavage, mélanger par rotation pendant 3 à 5 minutes, centrifuger et placer sur un support magnétique.
5. Rétro-liaison croisée : Suspendre les billes dans 200 μL de tampon d'élution direct. Aux échantillons d'entrée, ajouter le tampon de dilution ChIP pour obtenir un volume total de 192 μL, puis ajouter 8 μL de NaCl 5M. Incuber à 65℃ pendant au moins 4h.

Purification de l'ADN

Ajoutez 1 μL de RNase A et incubez à 37℃ pendant 30 minutes.
Ajoutez 1 μL de protéinase K et incubez à 4℃ pendant 1 h.
3. Ajoutez un volume égal de PCI, vortexez et centrifugez à 13 000 ×g pendant 5 minutes. Récupérez la phase aqueuse. Pour l'extraction arrière, ajoutez du TE/NaCl au tube d'origine et répétez l'extraction (la phase aqueuse combinée totalisera environ 400 μL).
4. Ajoutez 1 μL de glycogène et 900 μL d'éthanol à 100 %. Vortexez et incubez à -20℃ pendant 5 minutes. Centrifugez à 13 000 ×g pendant 5 minutes et éliminez le surnageant. Lavez le culot avec de l'éthanol à 70–80 %.
5. Suspendre l'ADN en granulés dans 50 à 100 μL de TE.

Préparation de bibliothèque NGS

1. Avant la préparation de la bibliothèque, analysez la distribution de taille des fragments d'ADN à l'aide d'un instrument TapeStation ou Bioanalyzer. Si aucun des deux n'est disponible, effectuez une électrophorèse sur gel d'agarose combinée à une coloration SYBR Gold qui améliore la détection de l'ADN à faible concentration.
2. Pour la préparation de la bibliothèque, utilisez un kit de préparation de bibliothèque ADN approprié selon les instructions du fabricant. Nous utilisons 20 à 30 ng d'ADN IP ou 50 à 100 ng d'ADN d'entrée pour chaque bibliothèque. Pour l'amplification de la bibliothèque, 10 à 15 cycles de PCR sont généralement utilisés.
3. Il est important de confirmer que les distributions de taille sont équivalentes entre les bibliothèques générées. La quantité d'ADN de la bibliothèque doit être quantifiée à l'aide d'une méthode basée sur la qPCR. Le kit de quantification de bibliothèque NGS Gen-Next peut être utilisé.

Référence :

1. Pei J, van den Dungen N A M, Asselbergs F W, et al. Protocole de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) pour de petites quantités de tissu cardiaque congelé biobancarisé[M]//Chromatine. Humana, New York, NY, 2022 : 97-111.