Directives de Soumission d'Échantillons
Questions et réponses sur le séquençage ChIP
Questions Générales
- Comment concevoir une expérience ChIP-Seq ?
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(1) Envisagez l'utilisation d'anticorps spécifiques pour enrichir efficacement des fragments d'ADN en fonction des objectifs de l'étude.
(2) Pour différents types de cellules, des méthodes spécifiques d'extraction des noyaux doivent être utilisées pour obtenir des noyaux intacts et en quantité suffisante.
La principale difficulté avec le ChIP-seq est la disponibilité des anticorps utilisés pour l'immunoprécipitation et la capacité à extraire des quantités suffisantes de noyaux intacts.
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(1) Envisagez l'utilisation d'anticorps spécifiques pour enrichir efficacement des fragments d'ADN en fonction des objectifs de l'étude.
- Devrais-je choisir ChIP-Seq ou ChIP-chip ?
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(1) Le ChIP-Seq permet une analyse véritablement à l'échelle du génome. Les sondes actuellement disponibles fixées sur la puce ne représentent que des séquences partielles du génome entier, et les informations d'hybridation obtenues sont biaisées.
(2) Pour l'analyse des sites de liaison, le ChIP-Seq peut atteindre une résolution de liaison de 10-30 pb en recherchant des "pics", tandis que les sondes sur la puce ne peuvent pas être localisées précisément en raison de leur longueur, et même le niveau le plus élevé des puces commerciales actuellement disponibles ne peut pas fournir une résolution comparable à celle du ChIP-Seq.
(3) Le nombre d'échantillons est requis. Le ChIP-chip nécessite jusqu'à 4-5 μg d'échantillon, ce qui nécessite une LM-PCR avant l'hybridation, mais peut entraîner des faux positifs en raison d'un fond accru, d'une amplification compétitive, etc. Le ChIP-Seq, en revanche, nécessite seulement des nanogrammes de matériel de départ, qui peuvent être aussi bas que 20 ng.
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(1) Le ChIP-Seq permet une analyse véritablement à l'échelle du génome. Les sondes actuellement disponibles fixées sur la puce ne représentent que des séquences partielles du génome entier, et les informations d'hybridation obtenues sont biaisées.
- Quelle méthode de construction de bibliothèque ChIP-Seq utilisez-vous ?
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Le séquençage Illumina est utilisé pour construire ses bibliothèques de séquençage ChIP-seq comme suit :
(1) Enrichissement ChIP des fragments d'ADN.
(2) Construction de bibliothèques de séquençage. Après purification des fragments d'ADN enrichis par ChIP, une série de traitements tels que l'aplatissement des extrémités, l'ajout d'extrémité 3' et la jonction ligaturée ont été effectués, et les fragments dans la plage de 150-300 pb ont été récupérés par découpe de gel électrophorétique, puis les fragments d'ADN récupérés ont été amplifiés par PCR et séquencés sur la machine. Les séquences mesurées sont d'abord soumises à un alignement génomique, puis à un comptage des sites de liaison en utilisant différents algorithmes.
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Le séquençage Illumina est utilisé pour construire ses bibliothèques de séquençage ChIP-seq comme suit :
- Quelles sont les principales étapes d'une expérience ChIP-seq ?
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(1) Liaison des histones et extraction des noyaux
Rupture de la membrane nucléaire et fragmentation du génome
(3) Pré-dépistage et immunoprécipitation
(4) Désassemblage des liaisons et purification de l'ADN
(5) Réparation de fin et liaison
(6) Purification et tri des fragments
(7) Amplification de bibliothèque et contrôle de qualité
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(1) Liaison des histones et extraction des noyaux
- L'amplification par PCR est-elle nécessaire lors du processus de préparation des échantillons et cela affecte-t-il le résultat final après l'amplification par PCR ?
- Étant donné que la quantité d'échantillons d'ADN provenant de ChIP est très faible, une étape d'amplification par PCR est nécessaire lors du processus de préparation des échantillons. Le principal objectif de l'amplification par PCR est d'obtenir une quantité suffisante d'ADN pour la réaction en ligne. Si le client peut fournir une quantité suffisante d'échantillons d'ADN, nous n'effectuons plus d'amplification par PCR. Étant donné qu'il s'agit d'une amplification linéaire, les résultats avant et après amplification sont très similaires et n'affectent essentiellement pas les résultats de séquençage.
- Quels autres facteurs peuvent affecter les résultats du ChIP-Seq ?
- La qualité des anticorps, la spécificité, la conception expérimentale, l'opération expérimentale du ChIP, la plage de longueur des fragments d'ADN, le débit de séquençage, la qualité du séquençage, etc. affectent tous les résultats du ChIP-Seq.
- Comment sélectionner des anticorps pour le Chip-Seq ?
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(1) En ce qui concerne les exigences de qualité des anticorps, les anticorps pour les expériences de ChIP doivent être de grade ChIP/IP ou supérieur.
(2) Si vous souhaitez étudier le site de liaison d'un facteur de transcription spécifique dans l'ensemble du génome, vous devez utiliser un anticorps spécifique généré avec ce facteur de transcription comme antigène. Si l'anticorps est difficile à obtenir ou peu efficace, vous pouvez également essayer d'utiliser un anticorps marqué, ce qui est préférable lorsque le sujet est une plante.
(3) Des anticorps étiquetés tels que His, GFP, Flag, HA, etc. peuvent être choisis. Cependant, il existe certains risques associés au système de tag. Tout d'abord, il faut se demander si la fusion de la protéine tag affectera la capacité du facteur de transcription à se lier à l'ADN. Ensuite, il faut considérer si la protéine tag elle-même a la capacité de se lier à l'ADN, ce qui peut produire des résultats faussement positifs. Enfin, il faut se demander si la protéine de fusion tag va concurrencer le facteur de transcription original pour se lier à l'ADN et affaiblir l'enrichissement ChIP.
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(1) En ce qui concerne les exigences de qualité des anticorps, les anticorps pour les expériences de ChIP doivent être de grade ChIP/IP ou supérieur.
- Comment configurer le contrôle d'entrée pour le séquençage ChIP ?
- Avant l'immunoprécipitation, vous devez prendre une partie de la chromatine cassée pour le contrôle d'entrée. Le contrôle d'entrée est l'ADN génomique cassé, qui doit passer par un processus de désolidarisation, de purification de l'ADN et de PCR finale ou d'autres méthodes pour être détecté avec l'ADN de l'échantillon précipité. Le contrôle d'entrée peut non seulement vérifier l'effet de la rupture de la chromatine, mais aussi être utilisé pour calculer l'efficacité de la ChIP.
- Comment mettre en place un contrôle positif et un contrôle négatif pour le séquençage ChIP ?
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Les contrôles positifs et négatifs sont les contrôles expérimentaux les plus basiques. Les contrôles positifs choisissent généralement des anticorps pour des protéines plus conservées qui se lient à des séquences connues, parmi les plus couramment utilisés figurent les anticorps contre les histones ou les anticorps contre l'ARN polymérase II, etc. Les contrôles négatifs sont généralement sélectionnés à partir d'IgG ou de sérum de l'hôte de l'anticorps de la protéine cible. Les résultats de l'anticorps de la protéine cible sont comparés avec les contrôles positifs et négatifs afin de tirer les bonnes conclusions.
Si la protéine cible n'a pas d'anticorps commercial adapté aux tests d'immunoprécipitation de la chromatine et que seuls des anticorps pour d'autres usages sont disponibles, un test d'immunoprécipitation de la protéine peut être réalisé en premier. Si l'anticorps peut précipiter avec succès la protéine, alors le test d'immunoprécipitation de la chromatine sera effectué.
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Les contrôles positifs et négatifs sont les contrôles expérimentaux les plus basiques. Les contrôles positifs choisissent généralement des anticorps pour des protéines plus conservées qui se lient à des séquences connues, parmi les plus couramment utilisés figurent les anticorps contre les histones ou les anticorps contre l'ARN polymérase II, etc. Les contrôles négatifs sont généralement sélectionnés à partir d'IgG ou de sérum de l'hôte de l'anticorps de la protéine cible. Les résultats de l'anticorps de la protéine cible sont comparés avec les contrôles positifs et négatifs afin de tirer les bonnes conclusions.
- Quels sont les facteurs qui conduisent à des faux positifs pour le ChIP-Seq ?
- Le séquençage à haut débit améliore considérablement la résolution des essais ChIP, mais ce n'est pas le seul facteur déterminant de la haute résolution. La longueur des fragments de chromatine interrompus après enrichissement immunitaire affecte également la résolution. Les méthodes de fragmentation de l'ADN, l'accessibilité de la chromatine, le biais d'amplification PCR, la duplication du génome et les erreurs de séquençage et d'alignement des séquences peuvent tous introduire des erreurs systématiques qui entraînent des faux positifs.
- Quelles méthodes de traitement des données peuvent être utilisées pour estimer la fiabilité des données brutes ChIP-seq ?
- Après le séquençage, les séquences sont d'abord appariées à des génomes connus et les véritables sites de liaison (pics) sont établis. Pour les facteurs de transcription, les gènes régulateurs en aval (gènes cibles) correspondant aux "pics" sont recherchés, ou des séquences de liaison conservées pour les sites de liaison des facteurs de transcription sont construites. Si les motifs des facteurs de transcription sont connus, le pourcentage des "pics" contenant les séquences de motifs peut être calculé. Si le motif du facteur de transcription est connu, le pourcentage des séquences de motifs dans la séquence du "pic" peut être calculé, ce qui peut estimer indirectement la fiabilité des résultats expérimentaux.
- Dois-je réaliser des essais de qPCR après ChIP ?
- Un essai qPCR est généralement réalisé après l'achèvement de la ChIP. Si vous étudiez les modifications des histones, un gène modifié par l'histone mais non affecté par la modification de l'histone est nécessaire comme contrôle pour le qPCR. Un ploidie d'enrichissement élevé (traitement/entrée) du gène indiquera un enrichissement significatif de la ChIP. Si l'étude porte sur des facteurs de transcription, plusieurs paires d'amorces peuvent être conçues pour des gènes cibles potentiels contre leurs régions géniques et régions promotrices afin de tester la spécificité de l'enrichissement de la ChIP.
- Quelle est la différence entre les billes d'agarose et les billes magnétiques lors de l'immunoprécipitation, et quelles billes sont les plus efficaces ?
- Les billes d'agarose ont une liaison non spécifique et doivent donc être pré-lavées avec de la chromatine pour éliminer les protéines ou l'ADN qui pourraient être liés de manière non spécifique à l'agarose protéine G, et la stratification n'est pas évidente, ce qui entraîne une perte facile des échantillons. L'avantage des billes magnétiques est que l'échantillon n'a pas besoin d'être centrifugé, le temps d'opération est court, et la surface des billes est lisse avec un faible bruit de fond, éliminant ainsi le besoin de confinement. Un autre avantage des billes magnétiques est qu'elles sont codées par couleur et présentent une stratification claire, ce qui permet de ne pas perdre l'échantillon, mais elles nécessitent un support magnétique.
Préparation des échantillons
- Quelles sont les exigences d'échantillon pour le ChIP-Seq ?
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(1) Échantillons d'ADN : concentration ≥ 10 ng/µl, quantité totale ≥ 20 ng, OD260/280 = 1,8-2,2. Si la quantité d'ADN n'est pas suffisante après un seul ChIP, il est recommandé de combiner l'ADN de 2 à 3 ChIPs ensemble.
(2) La bande principale de l'électrophorèse de l'ADN après interruption doit se situer dans la plage de 100 à 500 pb. Des amorces peuvent être conçues pour la vérification et la quantification par QPCR de l'ADN obtenu par ChIP.
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(1) Échantillons d'ADN : concentration ≥ 10 ng/µl, quantité totale ≥ 20 ng, OD260/280 = 1,8-2,2. Si la quantité d'ADN n'est pas suffisante après un seul ChIP, il est recommandé de combiner l'ADN de 2 à 3 ChIPs ensemble.
- Comment extraire les noyaux cellulaires pour le ChIP-Seq ?
- Pour prévenir la rupture de la membrane nucléaire, un grand nombre de fragments génomiques peuvent être perdus. Pour extraire les noyaux, nous devons prêter attention aux aspects suivants : tout d'abord, nous devons construire un système de tampon approprié pour maintenir l'équilibre de la pression osmotique de la membrane nucléaire ; deuxièmement, nous devons contrôler la vitesse de rotation pendant la centrifugation pour éviter la rupture de la membrane nucléaire ; troisièmement, nous devons marquer les noyaux avec des colorants fluorescents pour détecter l'intégrité des noyaux après extraction.
- Quelles sont les exigences en matière d'échantillons de cellules animales pour le ChIP-Seq ?
- Le nombre de cellules animales utilisées pour le ChIP devrait de préférence être de 10.7 ou plus, sinon il est difficile d'enrichir suffisamment de fragments d'ADN pour la construction de la bibliothèque. Pour obtenir des noyaux avec moins d'impuretés ou pour séparer les cellules dans différents états, une centrifugation sur gradient de densité est nécessaire. Si les noyaux doivent être conservés après extraction, ils doivent être congelés rapidement dans de l'azote liquide et stockés à -80°C.
- Dois-je électrophoréser les échantillons d'ADN pour les expériences de ChIP-Seq ?
- L'électrophorèse est nécessaire pour (1) tester l'effet de la fragmentation ultrasonique, la fragmentation ChIP nécessite entre 100 bp et 900 bp, trop courte pour garantir l'intégrité de la région de liaison des histones/facteurs de transcription, perdant une partie de l'information, trop longue pour contenir une région non ciblée, entraînant des faux positifs ; (2) tester l'intégrité de l'ADN génomique, pour la fragmentation ultrasonique, l'ADN de l'échantillon devrait se présenter sous la forme d'une seule bande d'ADN génomique intact.
- Quelles sont les considérations pour la fragmentation ultrasonique dans les expériences ChIP ?
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(1) Lors de l'utilisation d'un instrument de fragmentation ultrasonique à sonde, sélectionnez une sonde adaptée à votre volume d'échantillon.
(2) Dans tous les cas, les paramètres de cisaillement doivent être optimisés en fonction du volume de votre échantillon, de la densité cellulaire et du type de cellules.
(3) L'optimisation devrait inclure les réglages de puissance (temps de sonication par rapport au temps d'intervalle/temps de repos) et le nombre de cycles de cisaillement nécessaires pour obtenir des fragments d'ADN de longueur 200-1000 pb, en optimisant un seul paramètre par expérience d'optimisation.
(4) Faites attention aux réglages de temps et de puissance. Une fragmentation excessive et des réglages de puissance trop élevés peuvent endommager les épitopes lors de l'étape d'immunoprécipitation.
(5) Gardez toujours le lysat bien au frais et soniquez de manière intermittente plutôt que continue, car la chaleur générée par la sonication peut dénaturer la chromatine.
(6) Évitez les bulles d'air pendant la fragmentation par sonication. Les bulles provoquent une dénaturation de surface de la protéine et peuvent entraîner une perte de chromatine dans les bulles. Pour éviter cela, réglez d'abord la puissance à un niveau plus bas, puis augmentez-la progressivement.
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(1) Lors de l'utilisation d'un instrument de fragmentation ultrasonique à sonde, sélectionnez une sonde adaptée à votre volume d'échantillon.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
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