Protocole de préparation d'échantillons ChIP-Seq

Matériau de récolte et liaison croisée

1. Tissu animal : Transférez le tissu frais ou congelé rapidement (5–30 mg) dans un tube stérile de 1,5 mL et ajoutez un petit volume de PBS glacé + inhibiteurs de protéases (250 μL à 1,5 mL en commençant avec 5 mg et 30 mg de tissu, respectivement) pour homogénéiser le tissu avec un homogénéisateur de tissu. Ne laissez pas le volume dépasser 1,2 mL ; si cela se produit, divisez l'échantillon en deux tubes.
2. Complétez le volume de tissu homogénéisé avec du PBS glacé + des inhibiteurs de protéase (1 à 6 mL, à ajuster proportionnellement à la quantité initiale de tissu), et transférez dans un tube de 15 mL glacé.
3. Cellules en suspension : Commencez avec 10⁷ cellules (maximum de 5 × 10)⁷ cellules) qui sont centrifugées et les resuspendre dans 10 mL de PBS glacé.
4. Cellules adhérentes : Trypsinisez et collectez les cellules (10⁷ cellules, jusqu'à 5 × 10⁷ cellules) par centrifugation, éliminez le surnageant et ajoutez 10 mL de PBS froid.
5. Pour le réticulation simple : Ajoutez du formaldéhyde à une concentration finale de 1 % et incubez immédiatement les échantillons sous rotation douce pendant 10 minutes, à température ambiante.
6. Arrêtez la réaction en ajoutant de la glycine à une concentration finale de 150 mM et incubez les échantillons sous rotation douce pendant 5 minutes, à température ambiante.
7. Pour le double réticulation : Ajoutez de l'EGS (éthylène glycol bis(succinimidyl succinate)) à une concentration finale de 1,5 mM et placez les échantillons sous rotation douce pendant 30 minutes à température ambiante.
Ajoutez du formaldéhyde à une concentration finale de 1 % et incubez avec une rotation douce pendant 10 minutes à température ambiante.
9. Arrêtez la réaction en ajoutant de la glycine à une concentration finale de 150 mM et incubez les échantillons en les faisant tourner doucement pendant 5 minutes, à température ambiante.
10. Récoltez le tissu ou les cellules par centrifugation à 2000×g pendant 10 minutes à 4 °C.
11. Retirez le surnageant et ajoutez un volume égal de PBS glacé. Tapotez le tube jusqu'à ce que le culot cellulaire se détache.
12. Récoltez le tissu ou les cellules par centrifugation à 2000×g pendant 10 minutes à 4 °C. À ce stade, les échantillons peuvent être congelés rapidement dans de l'azote liquide et conservés à -80 °C pendant un mois maximum. Décongelez toujours les échantillons de tissu sur de la glace (cela peut prendre quelques heures si les pellets sont volumineux).

Isolation de la chromatine et sonication

1. Resuspendre le culot dans le tampon de lyse cellulaire. Pour un petit culot (10⁷ des cellules ou 5 mg de tissus génèrent un culot qui est plus petit que 50 μL—utilisez les repères sur le tube de 1,5 mL comme référence, ajoutez 1 mL de tampon de lyse cellulaire. Pour des culots plus volumineux, ajoutez 5 mL de tampon de lyse cellulaire et pipettez de haut en bas jusqu'à ce que le culot soit complètement dissous.
2. Incuber sur glace pendant 10 minutes.
3. Lors de la lyse des tissus : transférez la suspension tissulaire dans un homogénéiseur Dounce de 2 mL (gardé sur glace) et complétez la disruption tissulaire avec le pilon B (20 coups). Transférez le lysat dans un tube frais de 1,5 mL ou 15 mL (selon le volume du tampon de lyse cellulaire utilisé à l'étape 6). Lavez l'homogénéiseur avec 50 μL de tampon de lyse cellulaire et combinez les deux volumes.
4. Centrifugez le lysat à 2000×g pendant 5 minutes à 4 °C.
5. Retirez le surnageant et ajoutez le tampon de lyse nucléaire. Pour de petits pellets, ajoutez 500 μL de tampon, et pour des pellets plus gros, ajoutez jusqu'à 3 mL de tampon de lyse nucléaire. Incubez sur glace pendant 10 minutes.
6. Réservez un aliquote (10–15 μL) de la solution de chromatine et conservez-le sur glace. Cela sera utilisé comme témoin non soniqué, qui sera comparé à la chromatine soniquée pour vérifier l'efficacité de la sonication.
7. Soniquez vos échantillons. Comme la sonication dépend du type de cellule, de la composition tissulaire et du modèle de sonicateur, cette étape nécessite une optimisation. Lors de l'utilisation d'un sonicateur Covaris E220 avec des tubes en fibre AFA de 1 mL (jusqu'à 1,2 × 10⁷ cellules), nous recommandons les paramètres suivants comme point de départ : (PIP = 75, facteur de service = 2 %, CPB = 200, temps = 1 à 5 min).
8. Pipettez deux aliquotes (10–15 μL) des échantillons soniqués, l'une pour déterminer l'efficacité de la sonication et l'autre pour la quantification de l'ADN. Gardez les échantillons sur de la glace.
9. Centrifugez les échantillons à 18 000×g pendant 10 minutes à 4 °C pour éliminer les débris. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et gardez-le sur de la glace. À ce stade, la chromatine peut être congelée rapidement dans de l'azote liquide et stockée à -80 °C pendant un mois maximum. Décongelez toujours la chromatine sur de la glace comme décrit ci-dessus.
Ajoutez 10 μg de RNAse A à tous les aliquotes réservés et incubez pendant 30 minutes à 37 °C.
Ajoutez 20 μg de protéinase K à tous les aliquotes réservés et incubez pendant 1 h à 65 °C.
12. Faites bouillir les aliquotes pendant 10 minutes à 95 °C pour inverser les liaisons croisées et laissez les échantillons refroidir à température ambiante.
13. Pour vérifier l'efficacité de la sonication de l'ADN, analysez la taille des fragments d'ADN sur un gel d'agarose à 1 %. Si les échantillons sont soumis à un séquençage de nouvelle génération (NGS), la taille des fragments doit varier de 200 à 500 pb. Si la méthode d'analyse est la qPCR, les fragments doivent varier de 500 à 1000 pb.
14. Quantifiez l'aliquot réservé pour la quantification de l'ADN, en utilisant le kit de purification PCR QIAquick. L'ADN élut peut être quantifié sur un spectrophotomètre NanoDrop.