Directives de Soumission d'Échantillons
Analyse de ségrégation en vrac Questions et Réponses
Questions générales
- Comment fonctionne votre service d'analyse BSA ?
- Dans BSA (analyse de ségrégation en vrac)Dans une population en cours de ségrégation, les individus sont regroupés et mélangés selon le phénotype du trait cible, et les individus ou souches de la population sont divisés en deux groupes selon les différences relatives du trait cible. Ensuite, l'ADN des individus ou souches dans les deux groupes est mélangé séparément pour former un pool de mélange d'ADN relatif. Les pools parentaux et descendants sont séquencés, les SNPs sont détectés, et les valeurs d'index des pools descendants sont calculées sur la base des loci présentant des différences pures entre les parents, et les loci avec des différences plus importantes sont sélectionnés.
- Quels types de parents sont adaptés à la construction de la population ?
- Il est recommandé de sélectionner des parents avec des différences de traits uniques et peu de loci hétérozygotes autant que possible, et il est également conseillé que les différences entre les parents ne soient pas trop grandes, car si les différences parentales sont trop importantes, cela entraînera de nombreux faux positifs et facilitera la localisation de la région de faux positifs ; si vous sélectionnez deux variétés directement liées, il est facile de localiser la région candidate car les différences parentales sont trop faibles ; pour les parents du trait cible, il existe diverses façons d'obtenir les parents. Pour les parents du trait cible, il existe différentes méthodes pour obtenir les gènes candidats, telles que la mutagénèse EMS, les individus naturels, la mutagénèse par UV, qui peuvent toutes être utilisées pour localiser les gènes candidats par. BSA.
- Comment choisir une population pour l'ABM ?
- Selon le processus de formation de la population, les types de population sont généralement divisés en populations naturelles et en populations familiales. BSA La localisation de traits est appliquée pour identifier l'effet principal d'un seul trait dans une population familiale.
La source des parents est importante et il existe diverses méthodes pour obtenir des parents pour les traits cibles, telles que la mutagenèse EMS, les individus naturels, la mutagenèse UV, l'insertion de T-DNA, etc.
- Selon le processus de formation de la population, les types de population sont généralement divisés en populations naturelles et en populations familiales. BSA La localisation de traits est appliquée pour identifier l'effet principal d'un seul trait dans une population familiale.
- Comment construire une population familiale pour le BSA ?
- Il existe de nombreuses façons de construire la population familiale, parmi lesquelles F2, BC et RIL sont les populations courantes qui peuvent être utilisées pour l'analyse de sélection basée sur le phénotype (BSA). La génération F1 conventionnelle ne peut pas être utilisée pour la localisation des traits BSA car il n'y a pas de ségrégation des traits. Les DH peuvent également être utilisées pour la localisation des traits BSA, mais cela n'est pas courant en raison de la difficulté de construction.
- Est-il possible de tester uniquement les parents ? Ou uniquement le pool de descendants ? Ou seulement un pool de descendants ?
- (1) Si le caractère étudié est un trait de mutation induit par EMS, seules deux pools de sous-générations (type sauvage + mutant) peuvent être testées, ou un parent (type sauvage) et une pool de sous-génération (mutant) peuvent être testés ;
(2) Si le caractère étudié est un caractère quantitatif, il est recommandé de mesurer deux parents et deux pools de sous-générations. L'effet du nombre d'échantillons sur les résultats de l'analyse a été évalué par le projet en ligne actuel, dans lequel les meilleurs résultats ont été obtenus avec quatre échantillons (c'est-à-dire deux parents + deux pools de sous-générations), suivis d'un parent et de deux pools de sous-générations, et si seulement deux pools de sous-générations étaient mesurés, le nombre de faux positifs augmenterait et de nombreux SNP seraient obtenus.
- (1) Si le caractère étudié est un trait de mutation induit par EMS, seules deux pools de sous-générations (type sauvage + mutant) peuvent être testées, ou un parent (type sauvage) et une pool de sous-génération (mutant) peuvent être testés ;
- L'ADN peut-il être séquencé à partir d'échantillons de graines des parents, et l'ADN peut-il être séquencé à partir des feuilles des descendants ?
- Que l'ADN provenant de différentes parties du matériau affecte le Séquençage de l'ADN est principalement basé sur deux facteurs : d'abord, la composition de la peau de la graine et de l'endosperme, la peau de la graine provient généralement de la mère, si la peau de la graine est principalement affectée ; ensuite, le degré de pureté, si le degré de pureté est élevé, le parent et la descendance ne sont pas très différents, donc l'effet n'est pas significatif.
- Comment mélanger des pools d'ADN de descendants ?
- Il est recommandé d'extraire l'ADN de chaque échantillon de descendance séparément, puis de mélanger des quantités égales, ce qui peut réduire le bruit de fond et éviter les erreurs systématiques.
- Est-il possible de garantir la taille de la région candidate et le nombre de gènes candidats à localiser ?
- La taille de la région candidate et le nombre de gènes candidats sont liés à la taille de la population, à la taille des différences entre les matériaux parentaux, aux caractéristiques des traits cibles, à la profondeur du séquençage, au niveau génomique des espèces analysées et à de nombreux autres facteurs, qui peuvent être estimés en se référant à l'expérience du projet ou à la littérature publiée.
- L'intervalle de localisation est large, comment l'ajuster ?
- Vous pouvez ajuster l'intervalle de confiance ou sélectionner des marqueurs SNP et InDel dans l'intervalle de localisation BSA et effectuer un mapping local pour réduire efficacement l'intervalle de localisation.
- Comment valider les gènes cibles après le dépistage des gènes candidats ?
- (1) Validation des SNPs. (A) Convertir les SNPs candidats en marqueurs CAPS ou dCAPS, c'est-à-dire effectuer une analyse des sites de reconnaissance des endonucléases de restriction sur les SNPs candidats, éliminer les SNPs qui provoquent des changements dans les sites de reconnaissance enzymatique, amplifier les fragments où ces SNPs se trouvent en utilisant les amorces correspondantes, puis effectuer une digestion enzymatique et une électrophorèse sur les produits amplifiés pour convertir les SNPs en marqueurs CAPS ; effectuer une analyse de polymorphisme sur les marqueurs CAPS pour vérifier la disponibilité des marqueurs ; (B) Les SNPs candidats ont été amplifiés par PCR, puis les produits d'amplification ont été vérifiés par séquençage Sanger ;
(2) Validation de l'expression des gènes candidats à travers les phénotypes en utilisant la RT-PCR
(3) Analyse de l'expression différentielle basée sur le transcriptome pour voir s'il existe des différences significatives dans l'expression des gènes
Analyse de l'ARNi : utilisation de la technologie ARN interférent pour désactiver spécifiquement l'expression de gènes spécifiques.
- (1) Validation des SNPs. (A) Convertir les SNPs candidats en marqueurs CAPS ou dCAPS, c'est-à-dire effectuer une analyse des sites de reconnaissance des endonucléases de restriction sur les SNPs candidats, éliminer les SNPs qui provoquent des changements dans les sites de reconnaissance enzymatique, amplifier les fragments où ces SNPs se trouvent en utilisant les amorces correspondantes, puis effectuer une digestion enzymatique et une électrophorèse sur les produits amplifiés pour convertir les SNPs en marqueurs CAPS ; effectuer une analyse de polymorphisme sur les marqueurs CAPS pour vérifier la disponibilité des marqueurs ; (B) Les SNPs candidats ont été amplifiés par PCR, puis les produits d'amplification ont été vérifiés par séquençage Sanger ;
- Quelle peut être la raison de l'effet de positionnement insatisfaisant ?
- Il existe de nombreux facteurs qui conduisent à une localisation insatisfaisante, principalement les suivants :
(1) de grandes différences dans le patrimoine génétique entre les parents, il existe de nombreuses autres différences en plus du caractère cible, ce qui crée beaucoup d'interférences dans l'analyse et rend difficile la localisation ;
(2) les statistiques des traits complexes, le trait cible peut être composé de plusieurs traits simples, qui peuvent être divisés et re-localisés, et aussi les traits quantitatifs eux-mêmes sont difficiles à localiser et présentent une certaine incontrolabilité ;
(3) les données de séquençage sont contaminées, et les résultats de la comparaison peuvent être vérifiés en extrayant une partie des données de séquençage pour effectuer une comparaison blast dans la bibliothèque nr ;
(4) la méthode d'analyse n'est pas applicable, nous pouvons utiliser la méthode ED et la méthode SNP-index pour la localisation respectivement et comparer les résultats de localisation.
- Il existe de nombreux facteurs qui conduisent à une localisation insatisfaisante, principalement les suivants :
Préparation des échantillons
- Quelles sont les exigences pour les parents lors de la prise du matériel ?
- Les parents doivent être des individus aussi purs que possible, ce qui peut être purifié par auto-croisement. Les deux parents doivent avoir des différences significatives dans les traits cibles, mais d'autres traits doivent être aussi cohérents que possible pour réduire l'interférence des analyses de locus ultérieures.
- Quelles sont les exigences pour la population de descendants ?
- Théoriquement, tant que la descendance des croisements entre des parents avec des traits cibles différents produit une ségrégation des traits, elle peut être utilisée pour l'analyse de l'association par les marqueurs (BSA), mais les populations les plus couramment utilisées sont : F2, les populations de rétro-croisement, les lignées recombinantes d'autoincompatibilité, etc.
Pour les caractères qualitatifs, le rapport d'individus dominants à récessifs chez la descendance peut être de 1:1, 3:1, etc. Pour les caractères quantitatifs, les traits de la descendance devraient se conformer à une distribution normale.
- Théoriquement, tant que la descendance des croisements entre des parents avec des traits cibles différents produit une ségrégation des traits, elle peut être utilisée pour l'analyse de l'association par les marqueurs (BSA), mais les populations les plus couramment utilisées sont : F2, les populations de rétro-croisement, les lignées recombinantes d'autoincompatibilité, etc.
- Est-il possible de faire du BSA sans parents ?
- Oui, mais ce n'est pas recommandé. Actuellement, les algorithmes de localisation les plus courants sont la méthode ED et la méthode snp-index, parmi lesquels la méthode ED peut être réalisée sans parents, mais l'effet d'une telle localisation n'est certainement pas aussi bon que l'expérience avec des données de deux parents. Il est recommandé de re-hybrider pour construire la population et de conserver l'ADN parental pour une utilisation ultérieure.
- Quelle quantité d'échantillon est suffisante pour la descendance ?
- L'échantillonnage de la progéniture doit respecter les principes suivants : pour localiser les traits qualitatifs, il faut prendre autant d'individus récessifs que possible, avec un minimum d'au moins 20, généralement entre 30 et 50, puis le nombre correspondant d'individus dominants ; pour localiser les traits quantitatifs, les 5%-10% les plus extrêmes d'individus pour chaque trait sont généralement sélectionnés, et un histogramme similaire à celui-ci peut également être réalisé à partir des données des traits de la progéniture :
- La population de descendants n'est pas assez grande, devrais-je donner la priorité à la prise des extrêmes ou au nombre ?
- Il est difficile d'obtenir plus de 200 individus dans une population pour de nombreuses espèces, il y aura moins de 20 individus extrêmes. Nous suggérons donc plutôt de prendre moins d'échantillons que de sélectionner les échantillons avec des traits intermédiaires, ce qui n'interférera qu'avec l'analyse ultérieure. Bien sûr, il y a un certain risque que l'expérience avec seulement une dizaine d'échantillons par groupe ne produise pas de résultats satisfaisants.
- La extraction de l'ADN des filles doit-elle être mélangée d'abord puis extraite, ou extraite d'abord puis mélangée ?
- L'état idéal est d'extraire l'ADN de chaque échantillon fille individuellement, puis de les mélanger de manière égale et uniforme en un seul ADN selon la concentration d'ADN, afin que la quantité d'information ADN de chaque fille soit égale. Cependant, en raison du faible prix de transaction actuel des projets de séquençage, la pratique générale des entreprises est de laisser les clients prendre des quantités égales de mélange de tissus de chaque échantillon, puis d'extraire un échantillon d'ADN en pool mixte.
Le mélange et l'extraction d'échantillons de tissu égaux ne sont pas aussi efficaces que le mélange après l'extraction d'un échantillon unique, mais son impact est tout à fait acceptable. Bien que le mélange d'abord puis l'extraction entraîne des quantités inégales d'ADN provenant de chaque échantillon, si l'échantillonnage est suffisamment idéal, les génotypes de ces échantillons aux loci cibles devraient être cohérents, et l'impact principal est la composition du bruit de fond, qui n'affecte pas notre capacité à trouver les loci cibles plus tard dans l'analyse des données.
- L'état idéal est d'extraire l'ADN de chaque échantillon fille individuellement, puis de les mélanger de manière égale et uniforme en un seul ADN selon la concentration d'ADN, afin que la quantité d'information ADN de chaque fille soit égale. Cependant, en raison du faible prix de transaction actuel des projets de séquençage, la pratique générale des entreprises est de laisser les clients prendre des quantités égales de mélange de tissus de chaque échantillon, puis d'extraire un échantillon d'ADN en pool mixte.
- Quelle est l'exigence de qualité de l'ADN pour le resequencement ?
- Bien que les exigences spécifiques de chaque entreprise soient légèrement différentes, la qualité de l'ADN requise pour le resequencement n'est pas trop exigeante. Ce que vous devez faire vous-même, c'est de réaliser le gel d'agarose, d'observer si la bande principale est claire et exempte de contamination par des protéines, et également de vérifier la concentration et la quantité totale avec un spectrophotomètre (il est recommandé que la concentration ne soit pas inférieure à 20 ng/ml et que la quantité totale ne soit pas inférieure à 2 microgrammes).
- Quelle est l'exigence de profondeur pour les parents et la descendance lors du resequencement ?
- Afin de garantir l'exactitude des marqueurs SNP et InDel, le séquençage doit assurer une certaine profondeur, recommandée par les parents à ne pas moins de 20×. Le pool mixte doit être combiné avec le nombre d'échantillons pour déterminer que la moyenne de chaque échantillon n'est pas inférieure à 1×. Par exemple, si la descendance est de 30, ajoutons 30, alors la profondeur de séquençage de chaque pool mixte de descendance ne peut pas être inférieure à 30×. Si le financement le permet, cela peut ensuite être approfondi de manière appropriée.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
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