Protocole ATAC-Seq

Congélation de tissus

Congélation rapide

1. Collectez le tissu dans un cryovial stérile.
2. Plongez le cryovial contenant le tissu dans de l'azote liquide.
3. Conservez le flacon dans un réservoir de stockage d'azote liquide ou dans un congélateur à -80℃ pour un stockage à long terme.

Intégration et Gel d'OCT

1. Avant de congeler le tissu, préparez les cryomoules et étiquetez-les avec un marqueur.
2. Conservez l'OCT à température ambiante.
3. Mettez plusieurs gouttes d'OCT dans le cryomoule en plastique. Placez le tissu dessus en maintenant la bonne orientation pour la coupe. Versez délicatement de l'OCT sur le tissu en veillant à éviter les bulles jusqu'à ce qu'aucune partie du tissu ne soit exposée. Tenez le cryomoule en le maintenant droit à l'aide de pinces et introduisez-le dans l'azote liquide jusqu'à ce que le bloc soit congelé. Les blocs de tissu doivent être conservés à -80℃.

Sectionnement de tissus

1. Pour l'analyse histologique, coupez une section de cryostat de 5 à 10 μm d'épaisseur et montez-la sur une lame Superfrost Plus. Teignez les lames avec de l'hématoxyline-éosine (H&E) pour un examen histologique selon les méthodes standard. Le tissu peut être macro-disséqué à l'aide d'une lame stérile si nécessaire.
2. Pour l'isolement des noyaux, coupez 1 à 2 sections (50 μm) et introduisez-les dans un tube de 1,5 mL pré-refroidi.
Ajoutez 1 mL de PBS froid (1×) pour éliminer l'OCT.
4. Centrifugez à 1500 ×g pendant 1 minute à 4℃ et éliminez le surnageant.
5. Répétez les étapes 1 et 2 jusqu'à ce que l'OCT soit complètement éliminé.

Homogénéisation des tissus et lyse cellulaire

1. Après le retrait de l'OCT, resuspendre la section de tissu ou le tissu congelé instantanément dans 300 μL de tampon de lyse froid et homogénéiser le tissu jusqu'à obtention d'une homogénéité complète à l'aide de pilons jetables dans des microtubes de 1,5 mL.
2. Incubez les tubes pendant 10 minutes sur de la glace.
Ajoutez 1 mL de tampon de lavage.
4. Passez le tissu homogénéisé à travers un tamis cellulaire de 40 μm. Le filtrat doit contenir les noyaux.
5. Centrifugez les noyaux à 800 ×g pendant 10 minutes à 4℃ et retirez le surnageant.
6. Lavez les noyaux avec 300 μL de tampon de lavage.
7. Répétez les étapes 5 et 6 un total de 2 fois.
8. Jetez le surnageant et resuspendre dans 300 μL de tampon de lavage.
9. Comptez et visualisez les noyaux avec le compteur de cellules automatisé Countess® II FL teinté avec le réactif DAPI. Alternativement, les noyaux peuvent être comptés à l'aide d'un hémocytomètre.
10. Si la préparation des noyaux contient encore des débris et n'est pas suffisamment propre, répétez les étapes 4 à 7.
11. À cette étape, les noyaux sont prêts à procéder à la transposition pour l'analyse en vrac et en cellule unique. Les noyaux peuvent être conservés à ce stade resuspendus dans 90 % de FBS/10 % de DMSO à -80℃ ou dans de l'azote liquide pendant de longues périodes.

ATAC-Seq en vrac

1. Peler 5000–100 000 noyaux à 800 ×g pendant 5 minutes à 4℃.
2. Aspirez le surnageant sans perturber le culot.
3. Resuspendre le culot cellulaire dans 50 μL de mélange de transposition en pipetant de haut en bas 6 fois et ajouter 2,5 μL de transposase Tn5 (100 nM final).
4. Incubez la réaction à 37℃ pendant 30 minutes dans un thermomélangeur avec un mélange à 850 tr/min.
5. Purifiez en utilisant un kit Qiagen MinElute et éluez l'ADN transposé dans 12 μL de tampon d'élution.

Amplification de l'ADN

1. Amplifiez l'ADN transposé en préparant une réaction de 50 μL contenant : 12 μL de l'ADN transposé, 2 μL de l'amorce PCR personnalisée Nextera 1 à 5 μM, 2 μL de l'amorce PCR personnalisée Nextera 2 à 5 μM, 0,3 μL de SYBR Green I à 100×, 25 μL de NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix, et 8,7 μL d'eau sans nucléase.
2. Exécutez le programme de PCR suivant : 1 cycle de 5 min à 72℃ et 30 s à 98℃ suivi de N cycles de 10 s à 98℃, 30 s à 63℃ et 1 min à 72℃.
3. Le nombre de cycles dépend du nombre initial de noyaux transposés. Le protocole précédemment décrit (OMNI) recommande de réaliser une réaction initiale de 5 cycles, suivie d'une réaction secondaire de qPCR pour surveiller la réaction d'amplification afin d'estimer le nombre de cycles supplémentaires à ajouter. Cependant, pour faciliter le calcul des cycles nécessaires à l'amplification : ajoutez 15 cycles lorsque vous partez de <10 000 noyaux ; ajoutez 13 à 14 cycles pour 10 000 à 50 000 noyaux ; ajoutez 12 à 13 cycles pour 50 000 à 100 000 noyaux.
4. Procédez au séquençage de la bibliothèque, à l'analyse initiale des séquences et au contrôle de qualité (CQ).

Référence :

1. Cejas P, Long H W. Analyse ATAC-Seq à haute résolution des tissus cliniques congelés[M]//Chromatine. Humana, New York, NY, 2022 : 259-267.