Un aperçu des technologies de génotypage des SNP

Un polymorphisme nucléotidique simple (SNP) représente une variation dans un seul nucléotide qui se produit à une position spécifique dans le génome. Les SNP sont les principaux contributeurs aux variations de l'ADN entre les individus, avec une fréquence d'environ un pour 1 000 paires de bases. Il a été suggéré que les SNP sont responsables des différences phénotypiques et qu'ils affectent le développement et la progression de plusieurs maladies, ainsi que de déterminer la réponse au traitement médicamenteux et/ou au stress environnemental. De plus, les SNP peuvent servir de marqueurs moléculaires idéaux pour identifier les gènes associés à des caractères biologiques et des maladies importants. Par conséquent, le profilage des SNP est considéré comme d'une grande importance dans l'élevage sélectif, la production agricole et la productivité, la médecine personnalisée et le traitement médicamenteux.

Qu'est-ce que le génotypage SNP ?

Génotypage SNP se réfère à la détermination des loci SNP à l'échelle du génome entier ou au sein de régions génomiques d'intérêt. Les principales applications du génotypage SNP sont dans le traitement des maladies et les études de pharmacogénomique. Un grand nombre de technologies et de plateformes commerciales ont été développées pour le génotypage SNP. Selon l'objectif de recherche, le génotypage SNP peut être divisé en deux catégories : association génomique complète (AGC) et cartographie fineLes approches courantes pour le génotypage des SNP comprennent microarrays SNP, Génotypage SNP TaqMan, Génotypage SNP MassARRAY, et le séquençage à haut débit. Avec le développement rapide des technologies de génotypage SNP, un grand nombre de bases de données publiques ont été établies pour collecter les SNP identifiés (Tableau 1).

Tableau 1. Bases de données SNP.

1. Microarrays SNP

Les puces disponibles dans le commerce pour le génotypage SNP comprennent principalement les plateformes Affymetrix et Illumina. Les principes des deux plateformes sont décrits dans la Figure 1. Les solutions de génotypage Affymetrix et Illumina offrent des performances fiables en ce qui concerne la médecine de précision, le génotypage agricole, la criminalistique, les études à l'échelle de la population et les études d'association à l'échelle du génome (GWAS). Les puces SNP à haute densité disponibles dans le commerce couvrent la plupart du génome humain ainsi que d'autres plantes et animaux d'importance économique. Alternativement, des puces semi-personnalisées et personnalisées permettent aux chercheurs de choisir les marqueurs souhaités.

Figure 1. Vue d'ensemble de la technologie des puces SNP (laframboise 2009). (a) Dans les tests Affymetrix, il y a des sondes pour les deux allèles et l'ADN se lie aux deux sondes, quel que soit l'allèle qu'il porte. La liaison entravée se manifeste par un signal plus faible. (b) Dans les tests Illumina beadarray, une perle contient une séquence complémentaire à la séquence adjacente aux loci SNP. Lorsqu'elle se lie à l'ADN, elle présente différentes couleurs.

2. Génotypage SNP TaqMan

Génotypage SNP TaqMan fournit un moyen rapide et simple d'analyser les sites SNP. Les essais de génotypage SNP TaqMan comprennent désormais plus de 17 millions de collections préconçues pour une utilisation dans des formats d'instruments PCR en temps réel de 48, 96, 384 et OpenArray. Chaque collection préconçue comprend deux sondes TaqMan MGB spécifiques aux allèles marquées avec des colorants fluorescents distincts et une paire d'amorces PCR. Elles s'alignent de manière unique avec l'ADN pour offrir une haute spécificité pour l'allèle d'intérêt. Un colorant rapporteur en 5' et un colorant quench en 3' sont liés de manière covalente aux sondes. Lorsque les sondes sont intactes, la fluorescence est supprimée. Pendant l'extension PCR, l'activité exonuclease ne se produit que sur les sondes parfaitement appariées. Les colorants rapporteur et quench sont ensuite libérés en raison de l'activité exonuclease. Le signal fluorescent est mesuré pour déterminer le génotype de l'échantillon.

Figure 2. Le principe du génotypage SNP TaqMan.

3. Génotypage SNP MassARRAY

La plateforme MassARRAY présente plusieurs avantages pour les utilisateurs souhaitant un test de génotypage SNP personnalisé précis. Elle utilise un seul amorce d'extension pour générer des produits spécifiques aux allèles pour tous les sites PCR, garantissant un mélange de terminaison unique. Le test est basé sur l'extension d'amorces et implique une réaction d'extension d'amorces spécifique à un locus et une réaction d'extension d'amorces spécifique à un locus (test iPLEX). Dans le test iPLEX, un amorce d'oligonucléotide s'anneale immédiatement en amont du site SNP à génotyper. L'extension de l'amorce a ensuite lieu, qui est une seule base modifiée en masse complémentaire. La masse des produits étendus est déterminée par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Génotypage SNP MassARRAY peut analyser plusieurs sites SNP en une seule réaction. Cette méthode est précise et présente un avantage de coût lors de l'analyse de dizaines ou de centaines de SNP.

Figure 3. Les étapes du génotypage utilisant le système MassARRAY iPLEX (Svidnicki et al. 2015). (a) Réaction d'amplification spécifique au locus. (b) L'enzyme SAP neutralise les dNTP non incorporés. (c) Essai iPLEX. (d) Les produits sont analysés par la méthode MALDI-TOF. (e) Analyse des données.

Analyse des SNP par séquençage à haut débit

Le séquençage du génome humain a identifié plus de 3,1 millions de SNP validés. Les bases de données SNP développées fournissent des informations précieuses pour la conception d'études d'association et l'interprétation des données. Le séquençage est une approche puissante et à haut débit pour le génotypage des SNP, et plusieurs méthodes basées sur le séquençage ont été développées pour l'analyse des SNP, telles que génotypage par séquençage (GBS)L'analyse des SNP par séquençage de nouvelle génération (NGS) implique généralement la génération d'un produit d'ADN spécifique de régions génomiques sélectionnées, suivie d'un séquençage direct. Avec la réduction des coûts de séquençage, le séquençage de nouvelle génération (par exemple, Illumina, Roche 454, Ion Torrent) et le séquençage de troisième génération (par exemple, Nanopore, PacBio SMRT) deviennent largement disponibles.

Références :

1. Svidnicki M C C C C M, Silva-Costa S M, Ramos P Z, et al.Dépistage des altérations génétiques liées à la perte auditive non syndromique à l'aide de la technologie MassARRAY iPLEX®. BMC génétique médicale, 2015, 16(1) : 85.
2. Gabriel S, Ziaugra L, Tabbaa D. Génotypage SNP utilisant la plateforme Sequenom MassARRAY iPLEX. Protocoles actuels en génétique humaine, 2009, 60(1) : 2.12. 1-2.12. 18.
3. Komar A A. Polymorphismes nucléotidiques simples. Méthodes en biologie moléculaire, 2009, 578.