Séquençage Amplicon ITS : Technique, Flux de travail et Applications Fongiques

Les champignons jouent un rôle essentiel dans les écosystèmes et la santé humaine, pourtant la tradition méthodes d'identification—dépendant de la culture et de l'observation morphologique—échouent souvent à détecter les "microorganismes non cultivables" et ont du mal à classer avec précision des espèces étroitement apparentées. Séquençage d'amplicon ITSciblant la région de l'Espace Transcrit Interne (ITS) de l'ADN ribosomal fongique (rDNA) et tirant parti du séquençage à haut débit, permet une analyse rapide et sans culture des communautés fongiques à une résolution de l'espèce/sous-espèce, en faisant la norme mondiale.

Cet article explore les propriétés biologiques de la région ITS, décrit l'ensemble du flux de travail, de la collecte d'échantillons à l'analyse des données, et démontre ses applications à travers des études de cas agricoles, médicales et industrielles. Nous comparons les principaux outils logiciels d'analyse, proposons un cadre d'interprétation des données standardisé et discutons du potentiel du séquençage de troisième génération et de l'IA pour faire progresser la recherche fongique, en soulignant comment l'intégration multi-omique stimulera des études fongiques holistiques.

Qu'est-ce que le séquençage d'amplicons ITS ?

Les champignons, en tant que décomposeurs et symbiotes indispensables dans les écosystèmes, influencent directement l'efficacité du cycle du carbone, la fertilité des sols et la santé des plantes. En santé humaine, ils servent d'organismes industriels vitaux (par exemple, la levure) et d'agents pathogènes (par exemple, Candida, Aspergillus). Cependant, les méthodes traditionnelles d'identification des champignons reposant sur la morphologie et la culture présentent deux limitations critiques :

• Point aveugle des espèces non cultivablesLa plupart des champignons ne peuvent pas être isolés par culture pure, ce qui entraîne une sous-détection. Par exemple, les études sur le sol utilisant des approches traditionnelles ne détectent que 1 à 5 % de la diversité fongique, malgré la présence de dizaines de milliers d'espèces.
• Ambiguïté morphologiqueLes espèces étroitement apparentées présentent des traits similaires, rendant la classification au niveau des espèces/sous-espèces difficile.

Ces goulets d'étranglement soulignent l'urgence de disposer d'outils moléculaires à haut débit et de haute précision.

La percée révolutionnaire du séquençage des amplicons ITS

Le séquençage des amplicons ITS révolutionne la recherche sur les communautés fongiques en ciblant les régions ITS1 et ITS2 au sein de l'ADNr fongique. Combiné à des plateformes de séquençage à haut débit, il offre trois avantages clés :

• Sans cultureL'extraction d'ADN directement à partir d'échantillons environnementaux permet la détection de tous les champignons, y compris les espèces non cultivables.
• Résolution au niveau des espèces: Distingue des taxons étroitement liés, résolvant les lacunes de classification laissées par les méthodes traditionnelles.
• Évolutivité: Traite des centaines d'échantillons par course, identifiant des milliers d'unités taxonomiques opérationnelles (UTO).

Aujourd'hui, cette technique est la norme en matière d'analyse des communautés fongiques, appliquée dans les sciences de l'environnement, l'agroécologie et la microbiologie médicale.

Explication approfondie de la technologie de séquençage des amplicons ITS

La région ITS sert de "empreinte moléculaire" pour la classification fongique en raison de ses variations de séquence uniques, tandis que le flux de travail de séquençage d'amplicons standardise les opérations pour convertir ce marqueur moléculaire en données quantifiables. Ensemble, ils forment une chaîne technique complète, de la collecte d'échantillons à la résolution au niveau des espèces. Ci-dessous, nous explorons systématiquement les bases biologiques et le flux de travail expérimental de cette technologie.

Aperçu de la région ITS

La région de l'Espace Transcrit Interne (ITS), nichée au sein des clusters de gènes d'ARN ribosomal fongique (rRNA), constitue une pierre angulaire de la taxonomie fongique moderne en raison de son mélange unique de conservation évolutive et de variabilité. Structurellement, elle se compose de deux sous-régions : ITS1 (s'étendant entre les gènes d'ARNr 18S et 5.8S) et ITS2 (située entre les gènes d'ARNr 5.8S et 28S) — avec des longueurs variant généralement de 100 à 1 000 paires de bases, selon les espèces. Cette dualité en fait un marqueur moléculaire idéal : les gènes d'ARNr 18S, 5.8S et 28S flanquants évoluent lentement, fournissant des points d'ancrage stables pour la conception des amorces lors de l'amplification PCR, tandis que les régions ITS1 et ITS2 intervenantes accumulent rapidement des mutations, reflétant des événements de spéciation récents.

Flux de travail de séquençage d'amplicons ITS

• Collecte et traitement des échantillonsLa collecte d'échantillons doit être en accord avec les objectifs de recherche, en sélectionnant des matrices appropriées telles que le sol, les tissus végétaux ou l'eau. Pour les études fongiques du sol, le sol de surface est généralement collecté, tamisé à travers un maillage de 2 mm après avoir enlevé les débris végétaux afin de minimiser l'interférence des particules. Pour isoler les champignons associés aux racines, la "méthode de secouage des racines" sépare efficacement le sol de rhizosphère des microbes de surface des racines. Pendant le traitement, il est essentiel de maintenir un contrôle strict de la température et de l'efficacité temporelle pour prévenir la dégradation de l'ADN.
• Extraction et purification de l'ADNL'extraction de l'ADN est essentielle pour une analyse réussie. Les kits commerciaux d'ADN fongique utilisent la lyse chimique et la purification par membrane de silice pour éliminer efficacement les inhibiteurs tels que les acides humiques, produisant un ADN de haute pureté. Pour des échantillons difficiles, combinez le broyage à l'azote liquide avec l'extraction par CTAB pour briser physiquement les parois cellulaires et améliorer le rendement.
• Amplification par PCRL'amplification ITS utilise des amorces spécifiques aux champignons ciblant les régions ITS1 ou ITS2, couvrant la plupart des taxons fongiques. Optimisez les paramètres clés : la température d'annealing affecte la spécificité, le nombre de cycles détermine le rendement, et la concentration de Mg²⁺ régule l'activité enzymatique.
• Séquençage et analyse de donnéesLes amplicons purifiés subissent un séquençage en paires sur les plateformes Illumina MiSeq/NovaSeq, générant des millions de lectures brutes. Le pipeline d'analyse comprend le filtrage de qualité, le regroupement des OTU, l'annotation des espèces et les métriques de diversité.

Processus de séquençage des amplicons ITS

Applications du séquençage d'amplification ITS

Le séquençage d'amplification ITS s'est révélé indispensable dans des domaines allant de l'agriculture aux diagnostics cliniques, offrant une précision sans pareille dans l'analyse des communautés fongiques. Ci-dessous, trois études de cas démontrent son potentiel transformateur.

White et al. ont utilisé le séquençage des amplicons ITS pour caractériser la diversité du microbiome fongique. En analysant les données ITS provenant d'échantillons de liquide gastrique humain via le pipeline CloVR-ITS, ils ont identifié Candida quercitrusa (présent dans tous les échantillons) et Aspergillus spp. (détecté dans certains échantillons), confirmant la capacité de la méthode à distinguer les taxons fongiques dominants. En tant qu'outil compatible avec le cloud, CloVR-ITS simplifie l'analyse automatisée, rendant les études complètes sur les communautés fongiques plus accessibles.

Utilisation du séquençage d'amplicons ITS pour l'analyse des communautés microbiennes fongiques (White et al., 2022)

Sommermann et ses collègues ont analysé les communautés fongiques des sols agricoles en utilisant le séquençage d'amplicons ITS pour évaluer comment les méthodes de travail du sol, les niveaux de fertilisation et les schémas de rotation des cultures influençaient la diversité fongique. Leur étude a révélé que le séquençage des régions ITS1 et ITS2 a permis de détecter 296 genres fongiques et 3 398 unités taxonomiques opérationnelles (UTO), avec une richesse en UTO plus élevée pour l'ITS1. Les résultats ont indiqué que les stratégies de travail du sol modifiaient de manière significative les structures des communautés fongiques, tandis que la fertilisation avait un impact plus faible, statistiquement insignifiant. Par exemple, le genre Fusarium était fortement enrichi sous une fertilisation intensive dans des systèmes de travail du sol de conservation avec des cultures de maïs précédentes, tandis que Phoma était associé à un travail du sol conventionnel et à des cultures de colza précédentes. De plus, de nombreux champignons bénéfiques, tels que les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA), ont montré des réponses distinctes aux pratiques de travail du sol. Ces résultats fournissent une base scientifique pour optimiser la gestion de la biodiversité des sols dans les écosystèmes agricoles.

Application du séquençage d'amplicon ITS dans la recherche sur les communautés fongiques dans les sols agricoles (Sommermann et al., 2021)

Méthodes d'analyse des données pour le séquençage des amplicons ITS

Données brutes de séquençage à haut débit nécessite un contrôle de qualité, une annotation des espèces et une analyse de la diversité pour transformer les séquences nucléotidiques en métriques communautaires biologiquement significatives. Ci-dessous, nous décrivons les outils clés et les cadres logiques pour une interprétation efficace des données.

Approches analytiques pour les données de séquençage d'amplicons ITS

Logiciels et Outils Populaires : Comparaison Fonctionnelle et Stratégies de Sélection

QIIME2 et mothur dominent en tant que deux plateformes d'analyse principales. QIIME2 se distingue par son interface conviviale, prenant en charge des flux de travail modulaires (dénoyage DADA2, visualisation Phyloseq), idéale pour les débutants. En revanche, mothur propose des opérations flexibles en ligne de commande, permettant la personnalisation des paramètres tels que les algorithmes de regroupement OTU, s'adressant aux utilisateurs avancés. Pour les données fongiques, la combinaison de USEARCH (pour un regroupement OTU rapide) avec la base de données UNITE (pour l'annotation au niveau des espèces) améliore à la fois l'efficacité et la précision.

Analyse de données Flux de travail : Des données brutes aux connaissances biologiques

• Contrôle de la qualitéCommencez par évaluer la qualité des lectures brutes avec FastQC, puis taillez les bases de faible qualité (Q<20) et les séquences d'adaptateurs à l'aide de Trimmomatic. Dans les études sur le microbiome du sol, cette étape augmente généralement la proportion de lectures utilisables de 85 % à 95 %, garantissant des données fiables pour l'analyse ultérieure.
• Clustering des OTU et annotation des espècesUtilisez DADA2 ou UPARSE pour le regroupement des OTU. DADA2 génère des variantes de séquences d'amplicons (ASV) grâce à la dénaturation, atteignant une résolution au niveau du nucléotide unique, tandis qu'UPARSE regroupe les OTU à 97 % de similarité pour une compatibilité plus large. L'annotation des espèces repose sur le cadre "Hypothèse d'espèce" de UNITE, assignant avec précision plus de 90 % des séquences ITS à la taxonomie au niveau des espèces.
• Analyse de la diversitéUtilisez des indices de diversité alpha (par exemple, Shannon, Chao1) pour mesurer la richesse et l'uniformité des espèces au sein des échantillons, et des outils de diversité bêta (par exemple, distance de Bray-Curtis, graphiques PCoA) pour comparer les communautés microbiennes entre les échantillons. Par exemple, dans la recherche sur la restauration des forêts, l'analyse de la diversité bêta a révélé des différences significatives dans la structure de la communauté fongique entre les forêts secondaires et primaires (R²=0,65, p<0,01), principalement influencées par le pH du sol et la teneur en matière organique.

Interprétation des résultats : Traduire les données dans un contexte biologique

Interprétez les indicateurs de diversité en parallèle avec les facteurs environnementaux. Des valeurs de Shannon élevées indiquent souvent des systèmes écologiquement stables, tels que des sols sains avec des communautés microbiennes équilibrées, tandis que de faibles scores Chao1 peuvent signaler une perte d'espèces dans des environnements pollués. Validez les annotations des OTU fonctionnellement—par exemple, corrélez des abondances élevées de champignons pathogènes comme Fusarium avec des enregistrements de maladies des cultures, ou liez une présence accrue de champignons mycorhiziens arbusculaires (AMF) bénéfiques à une meilleure absorption des nutriments par les plantes.

Conclusion

Avec l'essor des technologies de séquençage de troisième génération comme PacBio, le séquençage des amplicons ITS passe d'approches à courtes lectures (Illumina) à des approches à longues lectures (PacBio HiFi), résolvant les variations de longueur des séquences ITS et améliorant la précision des assemblages. Des outils pilotés par l'IA, tels que des modèles d'apprentissage profond, optimisent l'alignement des longues lectures et l'élimination des chimères, abaissant les barrières techniques. Les avancées futures intégreront le séquençage ITS avec la métagénomique et la métabolomique, créant un cadre "multi-omique" pour la recherche fongique. Cette approche holistique fournira des informations plus approfondies sur la conservation écologique, l'agriculture durable et la santé humaine, répondant à des défis mondiaux tels que le changement climatique, la sécurité alimentaire et le contrôle des maladies infectieuses.

Le séquençage d'amplicons ITS est devenu la norme en matière d'études sur les communautés fongiques en raison de son haut débit et de sa précision. De la surveillance environnementale aux diagnostics médicaux, en passant par les applications agricoles et les processus industriels, cette technologie propulse la recherche fongique dans l'ère moléculaire, offrant des solutions critiques aux problèmes mondiaux.

Références:

1. White JR, Maddox C, et al. "CloVR-ITS : pipeline d'analyse de séquences d'amplicons de l'espaceur interne transcrit automatisé pour la caractérisation du microbiote fongique." Microbiome2013 ; 1(1) : 6. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou du contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
2. Sommermann L, Geistlinger J, et al. "Profils de communautés fongiques dans les sols agricoles d'un essai de terrain à long terme sous différentes conditions de travail du sol, de fertilisation et de rotation des cultures analysés par séquençage d'amplicons ITS à haut débit." PLoS One. 2018 ; 13(4) : e0195345. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.