Un guide du débutant sur le séquençage des amplicons 16S/18S/ITS

Qu'est-ce que le séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS ?

Séquençage d'amplicons il s'agit d'une approche ciblée qui se concentre sur des régions spécifiques de l'ADN ou de l'ARN au sein d'un échantillon. Elle implique l'amplification et le séquençage d'un gène particulier ou d'une région génomique d'intérêt. La région la plus couramment ciblée en écologie microbienne est le gène de l'ARNr 16S pour les bactéries et les archées. Ce gène contient des régions conservées qui permettent la conception de primers universels, capables d'amplifier et de séquencer un large éventail de taxons microbiens. En séquençant le gène de l'ARNr 16S, les chercheurs peuvent déterminer la composition taxonomique de la communauté microbienne présente dans l'échantillon. Le séquençage d'amplicons fournit des informations sur la diversité et l'abondance relative des différents taxons, mais est limité dans sa capacité à fournir des informations fonctionnelles.

Si vous souhaitez en savoir plus, veuillez consulter notre article. Principes et flux de travail du séquençage des amplicons 16S/18S/ITS.

Quelle est la différence entre la métagénomique et le séquençage d'amplicons ?

Séquençage métagénomiqueD'autre part, cela implique le séquençage de l'ensemble du matériel génétique (ADN ou ARN) présent dans un échantillon, sans cibler des régions spécifiques. Cela fournit un aperçu complet de l'ensemble de la communauté microbienne, y compris les microorganismes connus et inconnus. Le séquençage métagénomique peut identifier non seulement la composition taxonomique de la communauté, mais aussi le potentiel fonctionnel des microorganismes présents. En analysant l'ensemble du matériel génétique, les chercheurs peuvent étudier l'ensemble du génome microbien et identifier la présence de gènes et de voies spécifiques impliqués dans diverses fonctions telles que le métabolisme, la résistance aux antibiotiques et la virulence. Le séquençage métagénomique offre une résolution plus élevée en termes d'identification taxonomique et de potentiel fonctionnel par rapport au séquençage d'amplifiants, mais peut être plus exigeant sur le plan computationnel et financier.

Se référer à Introduction à la métagénomique par shotgun, de l'échantillonnage à l'analyse des données pour plus d'informations.

En résumé, le séquençage d'amplicons fournit des informations sur la composition taxonomique et l'abondance relative de taxons microbiens spécifiques au sein d'une communauté, tandis que le séquençage métagénomique offre une vue plus complète de l'ensemble de la communauté microbienne, y compris des informations taxonomiques ainsi que le potentiel fonctionnel. Le choix entre le séquençage d'amplicons et le séquençage métagénomique dépend des objectifs de recherche, des ressources disponibles et du niveau de détail requis pour l'analyse.

Séquençage Sanger vs. séquençage ciblé basé sur le NGS vs. séquençage à long lecture

Le séquençage d'amplicons, englobant à la fois le séquençage Sanger et les approches de séquençage de nouvelle génération (NGS), est devenu un outil puissant pour étudier les communautés microbiennes et l'analyse génétique ciblée. Comprendre les forces et les limites de chaque technique est crucial pour concevoir des stratégies expérimentales efficaces et interpréter les résultats avec précision.

En utilisant les principes de terminaison de chaîne, Séquençage de Sanger fournit des données de séquençage fiables et très précises, ce qui en fait un choix idéal pour confirmer et valider les résultats obtenus à partir de projets de séquençage d'amplicons à grande échelle. Cependant, en raison de son faible débit et de sa nature chronophage, le séquençage Sanger est moins adapté aux études à haut débit impliquant un grand nombre de fragments d'ADN.

Exploiter la puissance de séquençage de nouvelle génération des plateformes, telles que le séquençage Illumina, et en utilisant des stratégies comme le séquençage d'amplicons ou la capture hybride pour enrichir sélectivement les régions d'intérêt. La capacité à multiplexe des échantillons, où plusieurs échantillons sont regroupés et séquencés ensemble, augmente considérablement le débit et réduit les coûts par échantillon, facilitant ainsi l'analyse complète des variations génétiques complexes et des communautés microbiennes diverses.

De plus, il est essentiel de prendre en compte l'émergence de séquençage à lecture longue technologies, telles que Séquençage PacBio et Séquençage Oxford Nanopore, dans le contexte du séquençage d'amplicons. Le séquençage à longues lectures offre des avantages sans précédent, notamment des lectures de séquençage significativement plus longues dans des applications telles que l'assemblage de génomes de novo, le phasage des haplotypes et la caractérisation de réarrangements génomiques complexes. Néanmoins, il convient de noter que les technologies de séquençage à longues lectures présentent généralement des taux d'erreur plus élevés et ont des limitations en termes de débit et de coût par base.

Chaque méthode possède ses propres forces et considérations distinctes, nécessitant une réflexion attentive sur les objectifs de recherche, la taille de l'échantillon, la couverture souhaitée et les ressources disponibles.

ARNr 16S bactérien

Il existe trois types d'ARN ribosomal bactérien (ARNr) : l'ARNr 5S (120 pb), l'ARNr 16S (environ 1540 pb) et l'ARNr 23S (environ 2900 pb). L'ARNr 16S se trouve couramment dans les cellules procaryotes et a un contenu et un nombre de copies élevés (représentant plus de 80 % de l'ARN bactérien total), un accès facile aux modèles, une forte homologie fonctionnelle et une information génétique modérée. Les ARNr 16S se trouvent couramment dans les cellules procaryotes et ont un contenu et un nombre de copies élevés (80 % de l'ARN bactérien total).

Il y a neuf régions conservées et neuf régions hautement variables dans la séquence du gène codant pour l'ARNr 16S. Parmi celles-ci, la région V3-V4 présente une bonne spécificité et des informations complètes sur la base de données, ce qui en fait le meilleur choix pour l'annotation de l'analyse de la diversité bactérienne.

Le schéma du complexe ribosomique et du gène 16S rRNA. (Fukuda et al., 2016)

ARNr 18S eucaryote

Le gène de l'ARNr 18S est une séquence d'ADN codant pour une petite sous-unité des ribosomes eucaryotes, qui possède à la fois des régions conservées et des régions variables (V1-V9, sans région V6). Parmi celles-ci, la région V4 est la plus utilisée, dispose des informations de base de données les plus complètes et de la meilleure classification, et est le meilleur choix pour l'annotation de l'analyse du gène de l'ARNr 18S.

gène de l'ARNr 18S.

ARNr 16S archéen

Les archébactéries, également connues sous le nom d'archébactéries et d'archées, constituent une classe très spéciale de bactéries qui possèdent certaines caractéristiques à la fois des procaryotes et des eucaryotes. Pour la plateforme de séquençage Illumina 2×250 pb, le primer 519F/915R est le plus adapté.

Séquences ITS fongiques

Les séquences ITS sont des espaces transcrits en interne (ITS 1 et ITS 2), qui se situent entre les gènes d'ARNr fongiques 18S, 5.8S et 28S, respectivement. Les fragments de séquences ITS sont petits (350 pb et 400 pb pour ITS 1 et ITS 2, respectivement), faciles à analyser et ont été largement utilisés pour l'analyse phylogénétique de différentes espèces fongiques.

Études de séquençage à haut débit (HTS) des communautés fongiques. (Nilsson et al., 2019)

Analyse de la diversité des microorganismes fonctionnels spécifiques

Les microorganismes fonctionnels sont une classe de microorganismes qui ont suscité une attention considérable dans la nature en raison de leur importance fonctionnelle, tels que les bactéries nitrifiantes, les bactéries dénitrifiantes, les bactéries oxydantes de l'ammoniac, les bactéries réductrices de sulfate, les bactéries fixatrices d'azote, etc.

Chaque microorganisme fonctionnel peut être très différent sur le plan taxonomique, mais possède des gènes similaires qui leur permettent d'exercer la même fonction. Ainsi, les gènes qui permettent à ces bactéries fonctionnelles d'accomplir cette fonction spécifique sont appelés gènes fonctionnels, tels que nxrA, nirS/nirK, amoA, dsrB, nifH, nifH.

Flux de travail de l'analyse des données de séquençage d'amplicons

Les données en aval sont filtrées pour éliminer les lectures de faible qualité, et les données Clean de haute qualité restantes peuvent être utilisées pour une analyse ultérieure ; les lectures sont assemblées en Tags par la relation de chevauchement entre les lectures ; les Tags sont regroupés en OTUs avec une similarité donnée, puis les OTUs sont comparés à la base de données pour annoter les OTUs avec des espèces ; les résultats d'annotation des OTUs et des espèces ont été utilisés pour analyser la complexité des espèces d'échantillons et les différences d'espèces entre les groupes.

Pipeline d'analyse de séquençage d'amplicons de CD Genomics

Veuillez lire notre article. Analyse bioinformatique du séquençage d'amplicons 16S rRNA pour plus de détails.

Application de la technologie de séquençage des amplicons

Le séquençage d'amplicons trouve de vastes applications dans divers domaines, permettant aux chercheurs d'explorer et de comprendre les communautés microbiennes dans des environnements variés. Parmi les domaines d'application notables, on peut citer :

(i) Domaine médicalLe séquençage d'amplicons permet d'explorer la relation entre les microorganismes et les maladies humaines. Il aide à étudier le rôle des communautés microbiennes dans des conditions telles que les maladies métaboliques, les maladies digestives, les maladies auto-immunes, le cancer tumoral, les maladies neurologiques et d'autres affections. En profilant le microbiote, les chercheurs peuvent identifier des biomarqueurs potentiels, des cibles thérapeutiques et des interventions pour améliorer la santé humaine.

(ii) Élevage d'animauxLe séquençage d'amplicons joue un rôle crucial dans l'étude des interactions entre les communautés microbiennes dans l'intestin, le rumen et d'autres environnements associés aux animaux. Il aide les chercheurs à explorer l'impact du microbiote sur la reproduction, la croissance et le développement des animaux, la santé nutritionnelle, la fonction immunitaire et le traitement des maladies. En comprenant l'écologie microbienne dans les systèmes animaux, les scientifiques peuvent optimiser la santé et la productivité des animaux.

(iii) AgricultureLe séquençage des amplicons facilite l'étude des interactions microbiennes au sein de la rhizosphère et d'autres environnements associés aux plantes. Les chercheurs peuvent étudier les effets des pratiques agricoles telles que le labour, la fertilisation et la rotation des cultures sur les communautés microbiennes du sol. Comprendre l'interaction entre les microorganismes et les plantes aide à améliorer la productivité agricole, le cycle des nutriments, la santé des plantes et les pratiques agricoles durables.

(iv) Études environnementalesLe séquençage d'amplicons permet de caractériser les communautés microbiennes dans divers environnements, y compris des milieux pollués tels que le brouillard, la poussière, les zones résidentielles, les centres commerciaux et des habitats naturels comme les plans d'eau et les écosystèmes marins. Il aide à comprendre la distribution, la composition et la dynamique des populations microbiennes dans différents écosystèmes. De plus, le séquençage d'amplicons contribue à la recherche sur la fermentation et le traitement des engrais organiques, le traitement des eaux usées, la dégradation des huiles et d'autres processus environnementaux.

(v) BioénergieLe séquençage d'amplicons joue un rôle essentiel dans la recherche en bioénergie en permettant l'identification et la caractérisation de souches fonctionnelles spéciales et de gènes pertinents pour la production de biocarburants. Il aide à l'exploration des gènes et au développement de bactéries génétiquement modifiées avec des capacités améliorées pour la production de bioénergie.

(vi) Environnements extrêmes spéciauxLe séquençage d'amplicons est essentiel pour étudier les taxons microbiens prospérant dans des conditions environnementales extrêmes, telles que des températures extrêmes, une forte salinité, un pH acide ou alcalin, et d'autres environnements difficiles. En analysant la diversité microbienne et le potentiel fonctionnel dans ces environnements extrêmes, les chercheurs obtiennent des informations sur les stratégies d'adaptation des microorganismes et leur rôle dans la dynamique des écosystèmes.

Types d'échantillons pour le séquençage d'amplicons

Les techniques de séquençage d'amplicons, y compris le séquençage d'amplicons 16S, 18S et ITS, sont applicables à une large gamme de types d'échantillons.

Veuillez examiner notre Directives de Soumission d'Échantillons pour les méthodes de collecte et de manipulation d'échantillons de séquençage d'amplicons les plus complètes.

Références :

1. Fukuda, Kazumasa, et al. "Approches moléculaires pour étudier les communautés microbiennes : ciblage du gène de l'ARN ribosomal 16S." Journal de l'UOEH 38.3 (2016) : 223-232.
2. Nilsson, R. Henrik, et al. "Diversité du mycobiome : séquençage à haut débit et identification des champignons." Nature Reviews Microbiology 17.2 (2019) : 95-109.