Séquençage d'Amplification 18S : Un Outil Puissant pour l'Analyse des Communautés Microbiennes

les communautés microbiennes sont omniprésentes, se trouvant partout, des sols et des plans d'eau aux organismes vivants. Elles jouent un rôle indispensable dans le cycle des matériaux des écosystèmes, le flux d'énergie et le maintien de la santé humaine. Cependant, les méthodes traditionnelles d'identification microbienne, telles que l'isolement basé sur la culture et l'observation microscopique, présentent des limitations significatives. Les méthodes basées sur la culture ne peuvent détecter que les microorganismes cultivables, alors que la majorité des microbes sont difficiles à cultiver dans des conditions de laboratoire. Bien que l'observation microscopique permette une visualisation directe de la morphologie microbienne, elle est insuffisante pour classer et quantifier avec précision ces organismes. Dans ce contexte, Séquençage d'amplicons 18S la technologie a émergé.

Cet article fournit une introduction complète à la technologie de séquençage des amplicons 18S, couvrant ses principes et ses flux de travail, ainsi que des cas d'application multidisciplinaires, analyse de données méthodes, défis et solutions, ainsi que les perspectives de développement futur, offrant des références pratiques pour les chercheurs concernés.

Qu'est-ce que le séquençage d'amplicons 18S ?

Pour bien comprendre comment la technologie de séquençage des amplicons 18S fait progresser la recherche sur les communautés microbiennes, il est essentiel d'avoir une compréhension claire des principes scientifiques sous-jacents et des procédures opérationnelles spécifiques. Voici une introduction détaillée.

Aperçu du gène 18S rRNA

Le gène de l'ARNr 18S est un composant de la petite sous-unité ribosomique chez les eucaryotes et possède des caractéristiques structurelles uniques. Il contient à la fois des régions conservées et des régions variables. Les régions conservées sont très cohérentes entre les espèces, fournissant une base solide pour la conception de primers spécifiques. En revanche, les régions variables présentent des différences entre les différentes espèces, permettant de différencier des types microbiens distincts. En raison de sa présence répandue chez les eucaryotes et de sa structure relativement stable, le gène de l'ARNr 18S est devenu un marqueur moléculaire crucial pour la classification et l'identification des organismes eucaryotes, largement appliqué dans l'analyse des communautés microbiennes.

Flux de travail de séquençage d'amplicons 18S

Flux de travail du séquençage des amplicons 18S

• Collecte et traitement des échantillonsLa collecte d'échantillons est une étape cruciale pour garantir l'exactitude des résultats de recherche. Lors de la collecte, il est essentiel de prendre en compte la représentativité et l'homogénéité des échantillons tout en évitant la contamination externe. Par exemple, lors de la collecte d'échantillons de sol, retirez la couche superficielle et prélevez des échantillons à une profondeur spécifique pour minimiser les interférences des facteurs environnementaux. Traitez les échantillons collectés rapidement pour éviter des modifications dans la structure de la communauté microbienne. Les méthodes de traitement comprennent la congélation pour la conservation et le séchage, le choix dépendant du type d'échantillon et des objectifs de recherche.
• Extraction et purification de l'ADNLes méthodes courantes d'extraction de l'ADN incluent la méthode d'extraction au phénol-chloroforme et les méthodes utilisant des kits commerciaux. Bien que la méthode d'extraction au phénol-chloroforme puisse produire de l'ADN de haute qualité, elle est complexe, chronophage et implique l'utilisation de produits chimiques toxiques. Les kits commerciaux, en revanche, offrent simplicité et rapidité, mais la qualité et le rendement de l'ADN extrait peuvent varier en fonction de la marque du kit et du type d'échantillon. Quelle que soit la méthode choisie, la purification de l'ADN est d'une importance capitale. La purification élimine les impuretés introduites lors de l'extraction, telles que les protéines et les polysaccharides, améliorant ainsi la pureté de l'ADN et fournissant un modèle de haute qualité pour l'amplification PCR ultérieure.
• Amplification par PCRLa conception de primers spécifiques est le pivot de l'amplification par PCR. Les primers doivent présenter une haute spécificité et un conservatisme pour amplifier avec précision les fragments du gène 18S rRNA cible. Lors de la conception des primers, il est conseillé de se référer aux séquences de gènes 18S rRNA connues et d'utiliser des logiciels de bioinformatique pour l'analyse et la sélection. L'optimisation des conditions d'amplification PCR est tout aussi cruciale, impliquant des ajustements de paramètres tels que la température d'annealing, le nombre de cycles et la concentration de l'ADN modèle. Des conditions d'amplification appropriées peuvent augmenter le rendement et la spécificité des amplicons tout en réduisant l'amplification non spécifique et la formation de dimères de primers.
• Séquençage et analyse de donnéesLe choix d'une plateforme de séquençage à haut débit impacte directement l'exactitude et la fiabilité des résultats de séquençage. Actuellement, les plateformes couramment utilisées incluent Illumina MiSeq et HiSeq. La plateforme Illumina MiSeq offre des avantages tels que des longueurs de lecture relativement longues et des temps de course courts, ce qui la rend adaptée au séquençage de fragments plus petits. La plateforme HiSeq, en revanche, se distingue par son haut débit et son faible coût, idéale pour le séquençage d'échantillons à grande échelle. Le flux de travail d'analyse de données de base comprend le contrôle de qualité, le regroupement des OTU et l'annotation des espèces. Le contrôle de qualité améliore la fiabilité des données en éliminant les séquences de faible qualité, les séquences d'adaptateurs et les chimères. Le regroupement des OTU regroupe des séquences similaires, réduisant ainsi la complexité des données. L'annotation des espèces classe et identifie ensuite les OTU en fonction des informations de bases de données connues, fournissant des détails précis sur les espèces.

Domaines d'application du séquençage d'amplicons 18S

Tirant parti de ses avantages uniques, la technologie de séquençage d'amplicons 18S démontre un immense potentiel d'application dans divers domaines. Ci-dessous, nous explorons ses applications pratiques dans différents secteurs.

Étude de cas 1: Cibler les modifications m6A médiées par METTL5 dans l'ARNr 18S pour le traitement du carcinome hépatocellulaire

Dans une étude axée sur le carcinome hépatocellulaire (CHC), Peng et al. ont découvert que le complexe méthyltransférase m6A de l'ARNr 18S, METTL5-TRMT112, présente une expression régulée à la hausse dans plusieurs cancers et est corrélé à un mauvais pronostic. En analysant les modifications m6A sur l'ARNr 18S, ils ont révélé le rôle essentiel de METTL5 dans la tumorigenèse du CHC. L'absence de modifications m6A de l'ARNr 18S médiées par METTL5 compromet l'assemblage des ribosomes 80S, affectant par la suite la traduction des gènes impliqués dans le métabolisme des acides gras. De plus, ils ont identifié le rôle de l'ACSL4 dans le métabolisme des acides gras médié par METTL5 et la progression du CHC, suggérant que cibler à la fois l'ACSL4 et METTL5 pourrait inhiber de manière synergique la tumorigenèse du CHC, offrant ainsi de nouvelles cibles moléculaires pour la thérapie du CHC.

Étude de cas 2: Amorces spécifiques aux eucaryotes universels pour la recherche sur la biodiversité et le métabarcodage

Hadziavdic et al. se sont concentrés sur le gène de l'ARNr 18S pour concevoir et valider une paire de primers d'amplification "universels spécifiques aux eucaryotes", répondant à un besoin critique pour les outils de recherche sur la biodiversité. L'équipe a commencé par extraire 50 000 séquences eucaryotes 18S de la base de données SILVA, en comparant systématiquement les régions hypervariables comme V2, V4 et V9 pour leur densité d'information. Après avoir identifié la région V4-V5 comme cible optimale, ils ont utilisé le séquençage d'amplicons 18S (plateforme 454) pour amplifier et séquencer l'ADN de trois types de sédiments distincts de la mer du Nord norvégienne - sable fin, sable grossier et argile - générant plus de 500 000 lectures de haute qualité avec une longueur moyenne de 383 pb.

Les résultats ont confirmé l'efficacité des amorces : la combinaison F-566/R-1200 couvrait environ 80 % des entrées de la base de données eucaryotes tout en montrant une amplification négligeable des séquences procaryotes. Dans les tests pratiques, les amorces ont réussi à détecter plusieurs phylums, y compris Acanthocephala et Haplosporidia, dans des échantillons environnementaux, prouvant leur capacité à révéler la diversité eucaryote dans des écosystèmes complexes. Cette avancée fournit un outil universel pour les études de métabarcodage, rationalisant les évaluations de la biodiversité et soutenant les avancées dans des domaines comme la découverte de médicaments, où la compréhension des communautés microbiennes peut révéler de nouveaux composés bioactifs.

Le séquençage d'amplicons 18S révèle la biodiversité eucaryote (Taerum et al., 2021)

Méthodes d'analyse des données pour le séquençage d'amplicons 18S

Une analyse de données précise est essentielle pour libérer toute la valeur des résultats de recherche issus de la technologie de séquençage d'amplicons 18S. Ci-dessous, nous explorons les approches d'analyse de données pertinentes.

Logiciels et outils populaires

QIIME et mothur se distinguent comme deux options de logiciels d'analyse de données largement utilisés. QIIME se vante d'une interface conviviale et d'une suite complète de modules fonctionnels, prenant en charge l'analyse des données sur plusieurs plateformes de séquençage et couvrant l'ensemble du flux de travail, du contrôle de qualité à l'analyse de la diversité. Mothur, quant à lui, est réputé pour ses capacités d'analyse statistique et de visualisation robustes, permettant un forage et une exploration approfondis des données. Lors de la sélection d'outils d'analyse de données, il est essentiel de considérer de manière exhaustive les objectifs de recherche, les types de données et les niveaux de compétence personnels.

Flux de travail d'analyse des données

• Contrôle de la qualitéLes logiciels de contrôle de qualité comme FastQC et Trimmomatic offrent une évaluation complète et un prétraitement des données de séquençage. FastQC génère des rapports de qualité détaillés, présentant visuellement des informations sur la distribution de la qualité des séquences, le contenu en GC, et plus encore. Trimmomatic, guidé par des paramètres définis par l'utilisateur, supprime les séquences de faible qualité, les séquences d'adaptateurs et les chimères, améliorant ainsi la qualité et la fiabilité des données.
• Clustering des OTU et annotation des espècesLes méthodes courantes de regroupement des OTU incluent UPARSE et CD-HIT. L'algorithme UPARSE utilise une approche de regroupement itérative pour regrouper des séquences similaires avec une grande précision et efficacité. Pour l'annotation des espèces, des bases de données comme SILVA et Greengenes facilitent la détermination des informations taxonomiques des OTU par le biais de comparaisons de similarité de séquences.
• Analyse de la diversitéL'analyse de la diversité alpha évalue la diversité des communautés microbiennes au sein d'échantillons individuels, en utilisant des métriques telles que l'indice de Shannon et l'indice de Simpson. L'analyse de la diversité bêta compare les différences des communautés microbiennes entre les échantillons, en utilisant des méthodes telles que l'analyse PCoA et l'analyse NMDS. Ces techniques analytiques permettent aux chercheurs d'obtenir des informations approfondies sur la structure et la fonction des communautés microbiennes.

Étapes pour l'analyse des données

Interprétation des résultats

Prenons une étude sur les communautés microbiennes intestinales comme exemple. L'analyse des données a révélé des différences significatives dans la composition microbienne intestinale entre les individus en bonne santé et les individus obèses. Les individus obèses ont montré une augmentation marquée de certains microbes liés au métabolisme énergétique, accompagnée d'une diminution relative des microbes bénéfiques. Sur la base de ces résultats, les chercheurs ont émis l'hypothèse qu'un déséquilibre de la communauté microbienne intestinale pourrait contribuer au développement de l'obésité, fournissant une direction pour de futures recherches et interventions thérapeutiques.

Défis et solutions dans le séquençage des amplicons 18S

La contamination des échantillons représente l'un des problèmes les plus répandus rencontrés dans la technologie de séquençage des amplicons 18S. Lors de la collecte, du traitement et des opérations expérimentales des échantillons, des micro-organismes exogènes peuvent être introduits de manière involontaire, compromettant ainsi l'exactitude des résultats. Le biais des amorces est une autre préoccupation majeure ; en raison des limitations inhérentes à la conception des amorces, certains micro-organismes peuvent présenter une faible efficacité d'amplification, ne parvenant pas à refléter avec précision leur véritable abondance dans les échantillons. De plus, la complexité de l'analyse des données pose des défis pour les chercheurs, car le traitement et l'interprétation de vastes ensembles de données nécessitent des connaissances et des compétences spécialisées.

Pour traiter la contamination des échantillons, un design expérimental rigoureux est essentiel, incorporant des techniques aseptiques et des contrôles négatifs. Pour atténuer le biais des amorces, l'optimisation des séquences d'amorces et l'ajustement des conditions d'amplification peuvent réduire les écarts. Lorsqu'il s'agit de traiter la complexité de l'analyse des données, l'utilisation d'algorithmes avancés et de logiciels—tels que les approches d'apprentissage automatique et les modèles d'apprentissage profond—améliore la précision et l'efficacité.

Perspectives d'avenir

En regardant vers l'avenir, la technologie de séquençage d'amplicons 18S promet une intégration avec les techniques de séquençage unicellulaire, permettant une analyse précise des cellules microbiennes individuelles et des aperçus plus approfondis sur les interactions fonctionnelles au sein des communautés microbiennes. L'adoption de nouvelles plateformes de séquençage améliorera encore le débit et la précision tout en réduisant les coûts, soutenant ainsi les études à grande échelle des communautés microbiennes.

Dans la microbiologie environnementale, cette technologie fera progresser notre compréhension des rôles des écosystèmes microbiens, fournissant des bases scientifiques pour les efforts de restauration écologique et de conservation. En médecine, elle favorisera des approches de traitement personnalisées en analysant les profils microbiens uniques des patients. Pour l'écologie, la technologie offre des outils essentiels pour la protection de la biodiversité et la gestion durable des écosystèmes.

Références:

1. Peng H, Chen B, Wei W, Guo S, Han H, Yang C, Ma J, Wang L, Peng S, Kuang M, Lin S. "La N6-méthyladénosine (m6A) dans l'ARNr 18S favorise le métabolisme des acides gras et la transformation oncogénique." Métabolisme Nat2022 ; 4(8) : 1041-1054. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
2. Hadziavdic K, Lekang K, Lanzen A, Jonassen I, Thompson EM, Troedsson C. "Caractérisation du gène de l'ARNr 18S pour la conception de primers spécifiques aux eucaryotes universels." PLoS One2014 ; 9(2) : e87624. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes ou à leur contenu. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.