Guide complet des méthodes de séquençage de l'ADN

Les technologies de séquençage de l'ADN ont ouvert une nouvelle ère dans les sciences biologiques, nous aidant à mieux comprendre l'architecture génomique, les dynamiques évolutives, les mécanismes pathogènes, et au-delà. Alors que le domaine de la génomique prospère, l'éventail des technologies de séquençage disponibles s'élargit également. Ce guide explique les principales méthodes de séquençage. Il couvre leurs principes de base, leurs applications et les facteurs clés à prendre en compte lors du choix de la bonne technologie pour votre recherche.

1. Quels sont les différents types de technologies de séquençage de l'ADN ?

Séquençage de l'ADN implique la détermination précise des séquences de nucléotides au sein d'une molécule d'ADN. Au cours des dernières décennies, une pléthore de techniques de séquençage a émergé, chacune présentant des avantages et des limitations distincts. Le choix de la méthode de séquençage appropriée dépend des objectifs d'investigation, des caractéristiques de l'échantillon et de la complexité inhérente au projet de séquençage.

Séquençage de SangerLa pierre angulaire de l'analyse de l'ADN

Le séquençage de Sanger, ou séquençage par terminaison de chaîne, reste la norme d'or pour les efforts de séquençage ADN ciblé à faible débit. Cette méthode utilise des didéoxynucléotides (ddNTP) qui interrompent l'élongation des brins d'ADN. La séparation électrophorétique des fragments d'ADN résultants permet de déterminer la séquence en fonction des points de terminaison.

Malgré son exactitude et sa fiabilité inégalées pour les projets à petite échelle, le débit du séquençage Sanger reste comparativement limité. Il est indispensable pour le séquençage de petites régions d'ADN, les tests ciblés et la validation des résultats générés par les technologies de séquençage à haut débit. Sa capacité supérieure à résoudre des régions génomiques complexes, en particulier celles abritant des structures secondaires, en fait la modalité préférée pour détecter les mutations génétiques et confirmer les variants.

Séquençage de nouvelle génération (NGS)Exploration génomique à haut débit pionnière

Le NGS a révolutionné la recherche génomique. Contrairement au séquençage Sanger, qui analyse un fragment d'ADN à la fois, le NGS analyse des millions de fragments simultanément. Ces données aboutissent à la reconstruction de génomes entiers ou de régions d'intérêt ciblées.

La NGS se caractérise par ses capacités de haut débit, permettant un séquençage à grande échelle avec des délais d'exécution rapides et une rentabilité. Les techniques comprennent le séquençage par synthèse (SBS) d'Illumina, le séquençage à semi-conducteurs d'Ion Torrent et PacBio. Séquençage en temps réel à molécule unique (SMRT) permettre aux chercheurs d'exécuter séquençage du génome entier (SGE) et un séquençage ciblé avec une efficacité sans pareille.

Séquençage Long-Read : Naviguer dans des Paysages Génomiques Complexes

Les plateformes de séquençage à lecture longue, telles que celles développées par Oxford Nanopore et PacBio, offrent une alternative aux technologies de séquençage à lecture courte traditionnelles. Ces plateformes peuvent lire des fragments d'ADN considérablement plus longs, allant de kilobases (kb) à mégabases (Mb). Cette capacité facilite la résolution de régions génomiques complexes, y compris les séquences répétitives, les grands variants structurels et les réarrangements génomiques qui posent des défis aux méthodologies à lecture courte.

Un avantage notable du séquençage à longues lectures est sa capacité à produire des assemblages contigus avec un minimum de lacunes. Cela est inestimable pour l'assemblage de génomes de novo, la détection de variants structurels et l'exploration de régions génomiques complexes telles que les télomères et les centromères. Cependant, le séquençage à longues lectures est souvent associé à des taux d'erreur plus élevés par rapport aux technologies à courtes lectures, bien que les avancées en cours atténuent progressivement cette disparité.

Séquençage à molécule unique : Déchiffrer les brins d'ADN individuels

Les technologies de séquençage à molécule unique, y compris le SMRT de PacBio et le séquençage par nanopore d'Oxford Nanopore, sont à la pointe. Ces approches permettent le séquençage direct de molécules d'ADN individuelles sans amplification ni fragmentation. Dans le séquençage par nanopore, les brins d'ADN traversent un nanopore, la détermination de la séquence étant basée sur les variations de conductivité électrique induites par les nucléotides.

Le séquençage à cellule unique offre des avantages clairs, tels que le séquençage direct de longs fragments d'ADN en temps réel. Cela le rend particulièrement utile pour détecter des variations structurelles et d'autres caractéristiques génomiques complexes. Actuellement, le séquençage de molécules uniques fait face à des défis liés à des taux d'erreur plus élevés ; cependant, des améliorations continues des matériels et des outils informatiques améliorent sa précision.

2. Séquençage de Sanger : L'approche classique

Depuis plus de quarante ans, le séquençage de Sanger a servi de technique fondamentale dans le séquençage de l'ADN, maintenant son statut de méthode très précise et fiable, malgré l'émergence de technologies plus avancées.

Mécanisme du séquençage de Sanger

Le séquençage Sanger utilise des nucléotides terminaux de chaîne, spécifiquement des triphosphates de didéoxynucléosides (ddNTP), qui sont dépourvus du groupe 3'-OH nécessaire à l'élongation de la chaîne d'ADN. Dans un mélange de réaction comprenant des triphosphates de désoxy-nucléosides standard (dNTP) ainsi que des quantités limitées de chaque ddNTP, ces terminateurs interrompent la synthèse de l'ADN à des points aléatoires le long du brin modèle. Les fragments résultants sont ensuite triés par électrophorèse capillaire, la détermination de la séquence étant basée sur les longueurs des fragments et les ddNTP spécifiques incorporés.

Applications du séquençage de Sanger

Le séquençage Sanger est idéal pour des applications nécessitant une haute précision avec un faible débit, y compris :

• Séquençage cibléSéquençage de gènes discrets ou de régions génomiques spécifiques d'intérêt.
• Détection de mutationsIdentification des variantes génétiques connues dans les contextes de diagnostic clinique.
• Validation des résultats de NGSConfirmation des variantes ou des résultats qui ont été identifiés par des technologies de séquençage à haut débit.

Malgré sa précision, le débit limité du séquençage Sanger le rend moins adapté aux projets vastes, qui nécessitent une génération de données extensive. Néanmoins, il reste indispensable pour des applications précises et ciblées telles que l'analyse des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) et la validation des données d'expression génique.

Méthodes de séquençage de première génération. (Kübra Eren et al., Le journal eurasien de médecine, 2022)

3. NGS : Révolutionner la génomique

Les technologies NGS ont remarquablement redéfini l'étendue et la profondeur de l'analyse génomique. En facilitant le séquençage simultané de millions de fragments d'ADN, le NGS amplifie considérablement le débit tout en réduisant les coûts, révolutionnant ainsi à la fois les contextes de recherche et cliniques.

Types de plateformes NGS

Plusieurs plateformes de séquençage de nouvelle génération (NGS) sont largement utilisées, chacune offrant des avantages uniques en fonction des objectifs de séquençage spécifiques :

• Illumina (technologie SBS)En tant que plateforme la plus couramment utilisée, Illumina utilise le séquençage par synthèse (SBS), par lequel des nucléotides sont ajoutés à une chaîne d'ADN en expansion et détectés par des signaux fluorescents. Sa grande précision et sa diversité d'applications, y compris le séquençage du génome entier (WGS), le séquençage de l'ARN (RNA-Seq) et le séquençage ciblé, en font le choix privilégié pour les projets de séquençage à grande échelle.
• Ion TorrentEn utilisant la technologie des semi-conducteurs, Ion Torrent capture les fluctuations de pH résultant de l'incorporation de nucléotides. Il offre des vitesses de séquençage accélérées et est idéal pour des projets de séquençage à plus petite échelle et à coût réduit, tels que le séquençage ciblé et l'analyse mutationnelle.
• PacBio (séquençage SMRT)Le séquençage SMRT de PacBio permet le séquençage de longues lectures d'ADN en temps réel. Cette plateforme est essentielle pour l'assemblage complexe de génomes, l'analyse des variations structurelles et le séquençage de régions qui posent des défis aux technologies de séquençage à courtes lectures.
• Oxford NanoporeEn utilisant la technologie des nanopores, cette plateforme facilite le séquençage direct de l'ADN. Lorsque l'ADN traverse un nanopore, des variations de courant électrique sont enregistrées, permettant l'identification des nucléotides. Sa capacité de séquençage en temps réel et son expertise dans les séquences longues la rendent exceptionnellement polyvalente.

Applications du séquençage de nouvelle génération (NGS)

NGS est utilisé dans un large éventail d'applications, y compris :

• WGSAnalyse génomique complète à travers des organismes divers, englobant les génomes humains, microbiens ou végétaux.
• Séquençage de l'exome complet (WES)Séquençage ciblé des régions codantes du génome, essentiel pour élucider les maladies génétiques.
• RNA-Seq: Aperçu des profils d'expression génique et identification des phénomènes d'épissage alternatif.
• MétagénomiqueL'analyse des communautés microbiennes par le biais du séquençage de nouvelle génération (NGS) facilite l'exploration de la biodiversité, des microbiomes et de la génomique environnementale.

Préparation de la bibliothèque et méthode Illumina. (Kübra Eren et al., Le journal eurasien de médecine, 2022)

4. Au-delà du NGS : Technologies émergentes

En plus des méthodologies de séquençage classiques, les technologies émergentes élargissent les horizons du séquençage de l'ADN.

Technologies de séquençage à lecture longue

Oxford Nanopore Technologies et PacBio ont ouvert la voie à des avancées dans le séquençage à longues lectures, offrant des avantages notables par rapport au séquençage NGS à courtes lectures traditionnel. Ces méthodes avancées résolvent habilement des régions génomiques complexes, y compris les variants structurels, les séquences répétées et les télomères. La capacité de générer des longues lectures en temps réel rend ces technologies inestimables pour l'assemblage de génomes de novo, les analyses du génome humain et les projets d'envergure.

Séquençage de molécules uniques

Les plateformes de séquençage à molécule unique, telles que le SMRT de PacBio et les nanopores d'Oxford Nanopore, offrent un séquençage direct et en temps réel de fragments d'ADN étendus. Ces plateformes présentent un potentiel considérable pour les applications de génomique clinique, où une grande précision et de longues lectures sont nécessaires pour l'élucidation des troubles génétiques complexes et des variations structurelles.

Méthodes de séquençage de troisième génération. (Kübra Eren et al., Le journal eurasien de médecine, 2022)

5. Plates-formes de séquençage courantes et leurs dispositifs

Chaque plateforme de séquençage possède des forces et des limitations uniques, les rendant complémentaires dans la recherche génomique moderne. À mesure que la technologie de séquençage s'améliore, des facteurs tels que le coût, la précision et la rapidité continueront d'influencer l'utilisation de chaque méthode.

Plateforme de séquençage Illumina

En tant que leader dans le séquençage de nouvelle génération (NGS), Illumina détient une part de marché significative à l'échelle mondiale, dépassant 70 %. En utilisant la technologie de séquençage par synthèse (SBS), les plateformes Illumina offrent un haut débit et un séquençage précis dans un large éventail d'applications, y compris le séquençage de génomes entiers (WGS), RNA-Seq, et séquençage ciblé. Des appareils tels que le MiSeq et MiniSeq sont adaptés aux projets de petite à moyenne échelle, comme en témoigne séquençage de génomes microbiens et analyse des miARN, tandis que le HiSeq et NovaSeq les séries sont optimales pour des efforts à haut débit comme les études génomiques étendues.

Plateforme Ion Torrent

Pionnier par le développeur du séquençage Roche 454, la plateforme Ion Torrent a introduit une approche de séquençage révolutionnaire basée sur des semi-conducteurs. En éliminant le besoin de systèmes optiques coûteux, Ion Torrent offre une solution de séquençage plus économique et rapide. Le PGM Ion Torrent s'adresse à des projets de petite échelle comme le séquençage microbien ou d'exome, tandis que des modèles comme l'Ion Proton et l'Ion S5 visent à améliorer la capacité de traitement et à gérer des ensembles de données plus volumineux. Malgré son efficacité opérationnelle et sa facilité d'utilisation, la plateforme excelle dans le séquençage ciblé et le diagnostic clinique en raison de son débit comparativement inférieur à celui d'Illumina.

Plateforme de séquençage MGI (BGI Genomics)

MGI, une division de BGI Genomics, est devenue un concurrent redoutable dans le domaine du séquençage. Tirant parti de la technologie acquise auprès de Complete Genomics, MGI a développé des instruments de séquençage sophistiqués comme le MGISEQ-2000 et le DNBSEQ-T7, se concentrant sur la fourniture de séquençage à haut débit à des coûts réduits. Ces plateformes sont largement utilisées dans des applications allant du séquençage du transcriptome aux investigations à l'échelle de la population. L'entrée sur le marché de MGI marque un changement important vers la diversification du paysage dominé par Illumina, notamment dans des régions comme la Chine.

Séquençage PacBio (Pacific Biosciences)

En utilisant le séquençage SMRT, les plateformes PacBio telles que le Sequel II génèrent des séquences à lecture longue avec une précision élevée. Elles sont particulièrement adaptées pour l'assemblage de génomes de novo, l'élucidation des variants structurels et la caractérisation détaillée des régions génomiques complexes. Bien que les coûts par échantillon restent élevés, la capacité de PacBio à fournir des lectures longues très précises la rend indispensable pour les initiatives nécessitant des informations génomiques complètes.

Séquençage Oxford Nanopore

Grâce à l'utilisation de la nanotechnologie, Oxford Nanopore Technologies propose des solutions de séquençage en temps réel. Des outils comme le MinION sont portables et polyvalents, se révélant adaptés au travail sur le terrain, à la détection rapide des pathogènes et à l'analyse de longues séquences génomiques. Au-delà du séquençage de l'ADN, les plateformes Oxford Nanopore peuvent détecter des modifications de bases et des variations structurelles, offrant un avantage distinct pour une analyse en temps réel et adaptative. Cependant, en raison de sa précision inférieure par rapport à Illumina et PacBio, elle est plus adaptée à des applications de niche telles que l'épigénétique et la génomique structurale.

6. Comment choisir la bonne méthode de séquençage de l'ADN

Le choix d'une technologie de séquençage appropriée dépend de plusieurs facteurs, notamment l'échelle de l'étude, les considérations budgétaires, les exigences en matière de qualité des données et les objectifs de recherche spécifiques.

• Pour des projets à petite échelleLe séquençage Sanger reste idéal pour le séquençage ciblé et la validation des variants, offrant une grande précision malgré un faible débit.
• Pour des études à grande échelleLes technologies NGS, en particulier Illumina et Ion Torrent, sont optimales pour la recherche à haut débit telle que le séquençage du génome entier (WGS) ou le séquençage d'ARN (RNA-Seq), offrant un équilibre entre rentabilité, débit et précision.
• Pour les génomes complexes ou les variants structurelsDes technologies comme PacBio et Oxford Nanopore, bien adaptées aux régions génomiques difficiles et aux études sur les variants structurels, devraient être envisagées.

Comparaison des méthodes de séquençage:

En fin de compte, la décision dépend des objectifs de recherche, des contraintes budgétaires et de la profondeur de séquençage requise. Dans de nombreuses recherches contemporaines, combiner des méthodologies—comme le séquençage à haut débit (NGS) pour la découverte primaire suivi du séquençage Sanger pour la validation—donne des résultats optimaux.

En conclusion, le domaine du séquençage de l'ADN évolue continuellement. Le choix de la méthode de séquençage appropriée nécessite une réflexion minutieuse sur les besoins spécifiques du projet. En tant que pionnier en génomique, CD Genomics propose une vaste gamme de services de séquençage, tirant parti des technologies de pointe pour faciliter la prise de décision éclairée pour les chercheurs, garantissant l'acquisition de résultats de haute qualité et précis.

Références:

1. Eren, Kübra, Nursema Taktakoğlu et Ibrahim Pirim. "Méthodes de séquençage de l'ADN : du passé au présent." Le journal eurasien de médecine 54.1 (2022) : S47. doi : 10.5152/eurasianjmed.2022.22280
2. Slatko, Barton E., Andrew F. Gardner et Frederick M. Ausubel. "Aperçu des technologies de séquençage de nouvelle génération." Protocoles actuels en biologie moléculaire 122.1 (2018) : e59. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes ou à des contenus spécifiques en ligne. Si vous avez un texte que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
3. Van Dijk, Erwin L., et al. "La troisième révolution dans la technologie de séquençage." Tendances en Génétique 34.9 (2018) : 666-681. DOI : 10.1016/j.tig.2018.05.008
4. Hu, Taishan, et al. "Technologies de séquençage de nouvelle génération : un aperçu." Immunologie humaine 82.11 (2021) : 801-811. Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.