10x Genomics Cellule Unique : Principe, Flux de Travail, Applications

La technologie de séquençage de cellules uniques peut révéler l'hétérogénéité cellulaire et fournir des perspectives sans précédent sur les fonctions cellulaires, les interactions et les mécanismes de la maladie. 10x Genomics est un leader dans le séquençage de cellules uniques. Sa plateforme Chromium combine la technologie microfluidique et la technologie d'emballage en gouttelettes pour réaliser un séquençage à haut débit de cellules uniques. Cet article vise à introduire les principes de base, les procédures expérimentales et les applications dans différents domaines de la technologie de séquençage de cellules uniques de 10x Genomics.

Principes de la technologie de cellule unique 10x Genomics

La technologie de séquençage unicellulaire de 10x Genomics est basée sur la technologie microfluidique et permet une analyse unicellulaire à haut débit et haute précision grâce à la structure "Gel Beads-in-Emulsion (GEM)". Ce qui suit est une analyse détaillée des principes techniques :

Qu'est-ce que le séquençage de cellules uniques ?

La technologie de séquençage de cellules uniques vise à séquencer et analyser le génome, le transcriptome ou l'épigénome d'une seule cellule afin de révéler l'hétérogénéité et la complexité cellulaire. La plateforme Chromium de 10x Genomics est actuellement l'une des plateformes de séquençage de cellules uniques les plus utilisées. Son cœur réside dans l'utilisation de la technologie microfluidique pour encapsuler des cellules uniques et des réactifs de réaction dans des gouttelettes à l'échelle nanométrique, permettant ainsi une capture et une analyse de cellules uniques à haut débit.

Technologies de base de la plateforme Chromium

Les technologies de base de la plateforme Chromium de 10x Genomics comprennent les aspects suivants :

Technologie microfluidiqueLa plateforme Chromium utilise un système microfluidique à base d'eau dans l'huile (O/W) qui mélange des cellules uniques, des amorces, des enzymes et des réactifs de transcription inverse pour former des GEMs. Chaque GEM contient une cellule unique et son transcriptome ou ses informations génomiques.

structure GEMGEM est un microréacteur en forme de goutte composé d'une perle (perle de gel) et d'une émulsion eau-dans-huile. La surface de la perle est recouverte d'un code-barres codé (code-barres 10x), d'un code-barres moléculaire et d'amorces RT pour le décodage ultérieur des codes-barres et la quantification des transcrits.

système de code-barres 10xLes perles à l'intérieur de chaque GEM portent un code-barres moléculaire qui est utilisé pour distinguer les données de séquençage provenant de différentes cellules. Ces codes-barres se lient à un code-barres unique pour garantir l'unicité de chaque transcript.

Capture à haut débitLa plateforme Chromium peut traiter des milliers à des dizaines de milliers de cellules uniques simultanément, et chaque puce peut capturer jusqu'à 80 000 cellules, améliorant ainsi considérablement l'efficacité du séquençage de cellules uniques.

Figure1 .10X principes de fonctionnement du processus de génomique. (Li, Z., et al., 2022)

Le flux de travail de la structure GEM

Génération de gouttelettesAprès avoir mélangé la suspension de cellules uniques avec des billes et le réactif de transcription inverse, des GEMs sont générés à travers une puce microfluidique. Chaque GEM encapsule une cellule unique et son transcriptome ou ses informations génomiques.

Lyse cellulaire et transcriptionDans GEM, les cellules uniques sont lysées, l'ARNm est transcrit inversement en cDNA, et les transcrits sont étiquetés par un code-barres moléculaire.

Étiquetage par code-barresLes codes-barres sur les perles sont combinés avec de l'ADNc pour le décodage ultérieur des codes-barres et la classification des données.

Construction de bibliothèque de séquençageL'ADNc dans GEM est amplifié et la construction de la bibliothèque est séquencée pour générer des fragments d'ADN pouvant être utilisés pour le séquençage.

Types courants de séquençage de cellules uniques

La plateforme 10x Genomics Chromium prend en charge plusieurs types de séquençage à cellule unique, y compris :

Séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) : Utilisé pour analyser le transcriptome des cellules individuelles, révélant des changements dans le type et l'état des cellules.

Séquençage ATAC à cellule unique (scATAC-seq) : Utilisé pour étudier l'accessibilité de la chromatine des cellules individuelles et analyser les mécanismes de régulation des gènes.

Séquençage multimomique à cellule unique (scMultiome) : combine des informations sur le transcriptome et l'épigénomique pour analyser de manière exhaustive l'état fonctionnel des cellules individuelles.

Flux de travail du séquençage unicellulaire 10x Genomics

Le flux de travail de séquençage unicellulaire 10x Genomics est un processus hautement raffiné et systématique qui comprend principalement les étapes clés suivantes : préparation des échantillons, capture des cellules uniques et étiquetage par code-barres, construction de bibliothèques, séquençage à haut débit et analyse bioinformatique. Chaque étape est interconnectée pour garantir le bon fonctionnement de l'ensemble du processus, de la préparation des échantillons à l'analyse des données, fournissant ainsi des données transcriptomiques unicellulaires à haute résolution.

Préparation d'échantillons

Isolement et comptage des cellules : Tout d'abord, une suspension cellulaire unique doit être séparée des tissus ou des cellules cultivées. Des dispositifs tels que le compteur de cellules automatisé Countess II sont généralement utilisés pour compter les cellules afin de garantir que les concentrations cellulaires se situent entre 700 et 1200 cellules/μL pour assurer une récupération optimale.

Évaluation de l'activité cellulaire : Évaluer l'activité cellulaire par coloration, cytométrie en flux et d'autres méthodes pour s'assurer que le taux de survie cellulaire est supérieur à 80 %.

Capture de cellules uniques et étiquetage par code-barres

Capture de cellules uniques : Une suspension de cellules uniques est mélangée avec des billes codées par code-barres (billes en gel), et les cellules uniques sont dispersées dans des gouttelettes d'eau dans l'huile contenant les billes à travers une puce microfluidique pour former des GEMs.

Mécanisme d'allocation de codes-barres : Les billes dans chaque gouttelette contiennent un code-barres 10x unique qui est utilisé pour distinguer par la suite différentes sources de cellules uniques.

Construction de bibliothèque

Synthèse et amplification de cDNA : Dans des gouttelettes, les billes transcrivent l'ARNm en cDNA grâce à la transcriptase inverse et utilisent l'amplification par PCR pour générer une bibliothèque de cDNA.

Purification et contrôle de qualité de la bibliothèque : Purifiez et testez la qualité de la bibliothèque de cDNA amplifié pour garantir l'intégrité de la bibliothèque.

Séquençage à haut débit

Sélection de la plateforme de séquençage : Séquençage utilisant la plateforme Illumina, généralement avec des équipements tels que HiSeq X Ten ou NextSeq 550 pour générer des lectures PE de 150 pb.

Analyse bioinformatique

Pipeline d'analyse Cell Ranger 10x : Le logiciel Cell Ranger est utilisé pour le démultiplexage, l'allocation de codes-barres, le comptage de codes-barres moléculaires et d'autres processus afin de générer une matrice d'expression génique.

Réduction de dimension et analyse de clusters : Utilisez des outils tels que Seurat ou Scanpy pour effectuer une réduction de dimension (comme t-SNE ou UMAP) et une analyse de clusters sur des données d'expression génique afin d'identifier différents types de cellules.

Annotation des cellules et analyse de l'expression génique différentielle : Étudier les différences fonctionnelles entre différents types de cellules en annotant des gènes connus ou des génomes de référence, combiné à une analyse d'expression différentielle (telle que DESeq2 ou edgeR).

Applications de la technologie de cellule unique 10x Genomics

La technologie à cellule unique de 10x Genomics a un large éventail d'applications dans la recherche fondamentale, la recherche sur les maladies, l'immunologie et le développement de médicaments. C'est un outil puissant pour analyser l'hétérogénéité cellulaire, le développement des tissus et la détermination du destin cellulaire.

Recherche fondamentale

Analyse de l'hétérogénéité cellulaireLe séquençage à cellule unique peut identifier différents sous-types de cellules et analyser l'hétérogénéité et le regroupement des cellules, y compris les cellules neuronales et les cellules souches.

Développement des tissus et détermination du destin cellulaireCela aide à comprendre le développement des organes et des tissus des mammifères ainsi que la construction des lignées cellulaires en fonction des caractéristiques des différents sous-types cellulaires (Gupta, R., et al., 2020).

Recherche sur les maladies

Profilage unicellulaire dans le cancerLe séquençage de cellules uniques est utilisé pour reconnaître différents sous-types cellulaires au sein des tumeurs, étudier l'hétérogénéité des cellules tumorales et identifier de nouvelles voies et mécanismes pathogènes. Il peut caractériser les cellules tumorales, les cellules stromales et les cellules immunitaires infiltrées pour évaluer la progression tumorale et les réponses aux changements environnementaux.

Figure 2. Application des omiques unicellulaires dans la recherche sur les cellules tumorales. (Jia, Q, et al., 2022)

Troubles neurologiquesIl permet l'analyse des mécanismes de régulation moléculaire et de différenciation des cellules neuronales, aidant à comprendre les mécanismes des maladies neurologiques. Pour la recherche sur le développement du cerveau, il aide à obtenir une atlas d'expression génique des cellules cérébrales humaines et à analyser l'hétérogénéité cellulaire.

Typage des maladiesIl aide à découvrir des types de cellules anormales pour faciliter le typage des maladies.

Recherche en immunologie

Caractérisation des lignées cellulaires immunitairesLa technologie à cellule unique 10x est utilisée pour caractériser les lignées de cellules immunitaires en identifiant et en étiquetant différents sous-types de cellules immunitaires et en analysant leur diversité génétique. Par exemple, dans les expériences de séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq), des doubles de types cellulaires, qui expriment des marqueurs de plusieurs lignées, peuvent être identifiés (Majzner, R., et al., 2022). Cela peut inclure des cellules T (CD2, CD3E, CD3D, CD3G, CD247, CD7, CAR GD2), des cellules B (CD19, CD22, PAX5), des microglies/cellules myéloïdes (CD14, CD68, CD163, CSF1R, AIF1) ou des astrocytes (GFAP).

Applications en immunothérapieIl est utile en immunologie des tumeurs et en immunothérapie et peut aider à clarifier les mécanismes cellulaires et moléculaires du contrôle tumoral induit par le blocage des points de contrôle immunitaires (ICB).

Conclusion

La plateforme d'analyse cellulaire innovante développée par 10x Genomics représente une avancée dans la compréhension de la complexité biologique au niveau de la cellule individuelle. Grâce à des systèmes microfluidiques avancés et à la formation précise de gouttelettes, leur technologie Chromium facilite l'examen complet d'un grand nombre de cellules discrètes simultanément. Cette approche méthodologique a transformé la capacité des chercheurs à explorer la diversité cellulaire et à décoder des mécanismes biologiques complexes.

Les applications de la plateforme couvrent de nombreux domaines scientifiques, des investigations biologiques fondamentales au développement thérapeutique. Les chercheurs étudiant la biologie du cancer, les troubles du système nerveux et les réponses immunitaires ont tiré parti de cette technologie pour générer des informations sans précédent. La force particulière de la méthodologie réside dans sa capacité à analyser des milliers de cellules tout en maintenant une résolution exceptionnelle au niveau de la cellule unique.

Ce qui distingue cette approche, c'est sa polyvalence combinée à de solides capacités d'analyse. En permettant une investigation détaillée des processus cellulaires, des interactions moléculaires et des voies de la maladie, la plateforme a établi de nouvelles normes dans la recherche génomique. Cette avancée technologique continue d'accélérer la découverte scientifique à travers de multiples disciplines, contribuant de manière significative à la fois à la recherche fondamentale et aux applications cliniques.

Références :

1. Li, Z., Yin, L., Li, Y., Cao, Y., & Zeng, H. (2022). Le séquençage d'ARN à cellule unique révèle l'hétérogénéité cellulaire et génétique des cicatrices cutanées pour vérifier les effets thérapeutiques et le mécanisme d'action de la pommade Dispel-Scar dans l'inhibition des cicatrices hypertrophiques. Médecine complémentaire et alternative basée sur des preuves : eCAM, 2022, 7331164. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes ou à des contenus spécifiques en ligne. Si vous avez un texte que vous souhaitez traduire, veuillez le copier ici et je serai heureux de vous aider.
2. Gupta, R. K., & Kuznicki, J. (2020). Importance biologique et médicale de l'hétérogénéité cellulaire déchiffrée par le séquençage d'ARN à cellule unique. Cells, 9(8), 1751. Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
3. Jia, Q., Chu, H., Jin, Z. et al. Séquençage à haut débit de cellules uniques dans la recherche sur le cancer. Sig Transduct Target Ther 7, 145 (2022). Désolé, je ne peux pas accéder ou traduire des contenus à partir de liens externes.
4. Majzner, R. G., Ramakrishna, S., Yeom, K. W., et al. (2022). Thérapie par cellules T CAR GD2 pour les gliomes diffus de la ligne médiane mutés H3K27M. Nature, 603(7903), 934–941. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.