Recherche transcriptomique : transcriptomique unicellulaire et spatiale

Le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) et transcriptomique spatiale sont des techniques avancées qui présentent des avantages uniques pour élucider l'hétérogénéité cellulaire et l'architecture tissulaire. Ces méthodologies ont suscité un intérêt considérable dans divers domaines de recherche.

Séquençage d'ARN à cellule unique

Le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) représente une approche novatrice pour le séquençage à haut débit de l'ARNm au niveau de la cellule unique. Cette technique implique l'amplification efficace de quantités minimales d'ARNm extraites de cellules individuelles isolées, suivie d'un séquençage à haut débit. Les applications du séquençage à cellule unique couvrent plusieurs domaines, y compris la biologie du développement, l'oncologie, les neurosciences, l'immunologie, l'étude des mécanismes de la maladie et la construction d'atlas cellulaires.

Raisons pour l'analyse du transcriptome à cellule unique

Les cellules ne fonctionnent pas de manière isolée ; elles collaborent plutôt pour remplir des fonctions biologiques. Comme le dit le proverbe, "aucune feuille n'est exactement pareille," chaque cellule possède des caractéristiques uniques et joue des rôles distincts dans son environnement.

Les méthodes transcriptomiques traditionnelles, telles que séquençage d'ARN en vrac (ARN-seq en vrac), nécessite le broyage et l'extraction d'ARN total mélangé à partir d'organismes, de tissus ou de populations cellulaires pour le séquençage. Par conséquent, les données résultantes représentent des profils transcriptomiques moyennés provenant de divers constituants cellulaires. Cette approche a tendance à négliger les différences intercellulaires et obscurcit l'hétérogénéité cellulaire. En fait, l'ARN-seq en vrac décrit souvent un état hypothétique, qui peut ne pas refléter avec précision l'état réel des cellules individuelles.

En revanche, la technologie scRNA-seq peut révéler l'hétérogénéité et la complexité des transcrits d'ARN au sein de cellules uniques, ainsi que délimiter la composition de divers types de cellules et fonctions dans des tissus, organes et organismes hautement organisés. Cette avancée technologique a profondément transformé le domaine de transcriptomique.

Figure 1 : Comparaison entre scRNA-seq et Bulk RNA-seq

Avantages techniques

Révélation de l'hétérogénéité cellulaire et analyse à haute résolutionCette technique facilite l'identification des sous-populations cellulaires et des types de cellules rares, offrant des perspectives complètes sur les fonctions et les états cellulaires.

Investigation des processus dynamiquesLa scRNA-seq est adaptée pour explorer l'évolution de l'expression génique au cours de processus dynamiques tels que la différenciation cellulaire, la prolifération et la tumorigenèse.

Clustering de cellules impartialLa méthode permet une classification plus précise des cellules, en particulier dans les domaines de l'immunologie, de l'oncologie et de la génétique.

Mise en œuvre de la transcriptomique unicellulaire

La principale distinction entre le flux de travail opérationnel de la scRNA-seq et séquençage d'ARN en vrac traditionnel réside dans l'exigence d'isoler des cellules individuelles. Un processus typique de scRNA-seq se compose des étapes suivantes : collecte d'échantillons, isolation de cellules uniques, lyse cellulaire, transcription inverse, amplification d'ADNc, construction de bibliothèques, séquençage et analyse des données. Les plateformes technologiques scRNA-seq grand public actuelles incluent :

Plateformes microfluidiquesDes exemples incluent 10x Genomics, MobiNova et DNBelab C4, qui utilisent des puces microfluidiques et le principe d'immiscibilité entre l'huile et l'eau pour l'isolement de cellules uniques.

Plates à microtitrationPar exemple, la plateforme BD Rhapsody utilise la gravité pour faciliter le dépôt de cellules dans des micro-puits pour la séparation.

Transcriptomique spatiale

Transcriptomique spatiale permet la détection de l'expression de l'ensemble du transcriptome au sein des cellules tout en préservant leur localisation spatiale au sein du tissu. Cette approche permet une exploration plus approfondie de l'hétérogénéité spatiale. Ses applications englobent l'identification de types cellulaires rares, les études de croissance et de développement, l'exploration des mécanismes de la maladie et l'analyse du microenvironnement tumoral.

Dans le séquençage unicellulaire, des cellules d'échantillon peuvent être perdues lors de la dissociation des tissus et du traitement microfluidique, ce qui peut entraîner une distorsion des informations. De plus, le séquençage unicellulaire entraîne souvent la perte de données de position spatiale pour les cellules. La transcriptomique spatiale répond à la carence d'informations spatiales qui est inhérente à la transcriptomique unicellulaire.

Avantages techniques

Rétention de l'information spatialeCette méthodologie préserve les positions spatiales de l'ARNm au sein des sections de tissu, révélant les interactions intercellulaires et la structure organisationnelle, ce qui la rend particulièrement applicable aux études impliquant des tissus morphologiquement distincts tels que le cerveau, les embryons et les bulbes olfactifs.

Analyse transcriptomique complèteIl fournit un aperçu complet de l'expression des ARNm au niveau cellulaire, améliorant la compréhension de l'activité cellulaire au sein de tissus complexes. Dans la recherche en oncologie, cette technique peut révéler des gradients d'expression génique et une hétérogénéité au sein des régions tumorales.

Mise en œuvre de la transcriptomique spatiale

Actuellement, diverses méthodes existent pour mettre en œuvre la transcriptomique spatiale, y compris des techniques d'imagerie basées sur l'hybridation in situ et celles reposant sur le séquençage transcriptomique. Parmi celles-ci, la plateforme de séquençage transcriptomique à haut débit, 10x Visiumest l'une des technologies commerciales les plus établies.

La plateforme 10x Visium utilise la technologie des microarrays pour déposer des matrices d'oligonucléotides ordonnées sur des lames de verre. Par la suite, de fines sections de tissu sont placées sur la matrice, et la perméabilisation permet la diffusion de l'ARN cellulaire vers les oligonucléotides contenant des codes-barres. La transcription inverse in situ génère de l'ADNc avec des indices spatiaux, qui est ensuite soumis à un séquençage à haut débit.

Figure 2 : Principes du séquençage en transcriptomique spatiale 10x Visium

Analyse intégrée des données de transcriptomique unicellulaire et spatiale

Ces dernières années, émergentes technologies de transcriptomique spatiale ont permis la reconstruction de l'architecture tissulaire et du positionnement spatial cellulaire. Cependant, la résolution de ces technologies est souvent insuffisante pour atteindre une précision au niveau de la cellule unique. Par conséquent, l'intégration de la transcriptomique spatiale avec la transcriptomique à cellule unique peut créer des cartes spatiales à haute résolution au niveau de la cellule unique, produisant un effet synergique qui dépasse les applications individuelles de chaque technique. Les sections suivantes exploreront les cadres conceptuels pour l'analyse d'association de ces deux méthodologies, complétés par des études de cas pour illustrer leur application.

Méthodes et principes d'analyse

Deux approches analytiques principales pour intégrer les données transcriptomiques unicellulaires avec les données transcriptomiques spatiales sont la déconvolution et le mapping. Fondamentalement, ces méthodes impliquent l'intégration des cartes unicellulaires, telles que fournies par la transcriptomique unicellulaire, avec des cartes spatiales dérivées de la transcriptomique spatiale, construisant ainsi un atlas spatial unicellulaire. Les sections suivantes mettront l'accent sur les stratégies analytiques et les méthodologies employées dans ce processus d'intégration.

Figure 3 : Approches stratégiques pour l'analyse intégrative de la transcriptomique unicellulaire et spatiale

Déconvolution

La déconvolution fait référence au processus de séparation des signaux transcriptomiques mélangés obtenus à partir d'échantillons résolus spatialement en leurs types cellulaires constitutifs. En s'appuyant sur les profils transcriptomiques unicellulaires, cette méthode permet d'estimer l'abondance de différents types cellulaires au sein de régions spatiales spécifiques d'un échantillon de tissu.

Cartographie

Le mapping consiste à aligner les données transcriptomiques unicellulaires sur le cadre transcriptomique spatial. Cette méthode permet de visualiser les profils d'expression unicellulaire dans le contexte de l'architecture tissulaire, facilitant une compréhension plus approfondie des interactions cellulaires et des états fonctionnels in situ.

L'intégration de ces méthodologies constitue une stratégie puissante pour élucider les complexités de l'organisation des tissus et du comportement cellulaire. Grâce à une application soigneuse des techniques de déconvolution et de cartographie, les chercheurs peuvent obtenir des informations inestimables sur la composition cellulaire et la dynamique fonctionnelle de divers systèmes biologiques.

Caractéristiques génétiques cellulaires

La construction de cartes cellulaires spatiales à cellule unique permet d'examiner les schémas de distribution des sous-populations de cellules cibles, ainsi que la distribution spatiale et spécifique aux sous-populations des gènes cibles. Par la suite, une analyse différentielle des gènes et une analyse d'enrichissement peuvent être réalisées pour identifier les gènes avec la plus forte régulation à la hausse en tant que gènes caractéristiques de la sous-population, éclaircissant ainsi leur distribution à travers des sous-populations cellulaires spatiales et diverses.

Localisation et Corrélation

Une analyse plus approfondie peut explorer la co-localisation des gènes et des cellules, révélant les interactions récepteur-ligand et les relations de régulation transcriptionnelle, ainsi que les interactions intercellulaires. De plus, des régions spatiales, des cellules et des gènes peuvent être corrélés avec des données phénotypiques des tissus, permettant d'examiner la relation entre les distributions des caractéristiques spatiales et les fonctions phénotypiques.

Trajectoires de développement

Par la suite, une analyse de pseudo-temps spatial peut être utilisée pour construire les trajectoires de différenciation en pseudo-temps spatial des cellules. En combinant l'analyse des gènes différentiels, des gènes de caractéristiques développementales spatialement pertinents et des gènes moteurs de différenciation des sous-populations peuvent être identifiés, éclairant ainsi les mécanismes régulateurs de la différenciation développementale cellulaire. De plus, l'analyse de la vélocité de l'ARN peut aider à inférer les dynamiques directionnelles de la différenciation cellulaire, servant à valider les résultats obtenus à partir des analyses de pseudo-temps.

Communication cellulaire

De plus, des informations sur les relations d'interaction entre les sous-populations cellulaires peuvent être dérivées des données de positionnement spatial et des interactions récepteur-ligand. Après avoir identifié les paires de cellules clés interagissantes, des investigations supplémentaires sur leurs paires de gènes récepteurs et les mécanismes régulateurs moléculaires peuvent être menées, ainsi que des analyses des différences intergroupes pour évaluer l'impact des traitements expérimentaux sur la communication cellulaire.

Régulation des gènes

Enfin, l'intégration de l'analyse des facteurs de transcription et de l'analyse des réseaux peut faciliter la construction de réseaux de régulation transcriptionnelle. Cette approche permet d'identifier des gènes et des facteurs de transcription clés, ainsi que d'examiner leur co-expression spatiale, révélant ainsi les mécanismes régulateurs des voies critiques et leurs associations avec les phénotypes.

Cas d'application

Les sections suivantes illustreront comment les stratégies de recherche mentionnées ci-dessus sont appliquées à travers deux études de cas spécifiques.

Étude de cas 1

Dans un article de 2023 publié dans Cellule (Impact Factor = 45,5), les auteurs ont réalisé des transcriptomiques unicellulaires et des transcriptomiques spatiales sur diverses régions du cerveau humain à 6-23 semaines de gestation (SG). Cette étude a construit un atlas spatiotemporel du cerveau humain, révélant les schémas de distribution spatiale des différents types cellulaires (voir Figure 2AB). Les auteurs ont également exploré l'hétérogénéité des cellules progénitrices neurales humaines (CPN), les classant en cinq sous-populations. Parmi celles-ci, les cellules gliales radiales (CGR) se sont révélées être la première population, présentant une hétérogénéité régionale significative. De plus, le facteur de transcription TFAP2C était spécifiquement exprimé dans les cellules CGR et a été trouvé pour déterminer leur destin. Cette étude a efficacement utilisé la première stratégie de recherche pour enquêter sur les caractéristiques de distribution spatiale des sous-populations cellulaires au sein du cerveau humain.

Figure 4 : Atlas transcriptomique spatiotemporel du développement du cerveau humain

Par la suite, les auteurs ont utilisé l'analyse du pseudo-temps pour reconstruire les trajectoires de développement de sous-populations neuronales spécifiques provenant de cinq régions cérébrales distinctes. Il a été observé que les cellules gliales radiales corticales (vRG et oRG) se différencient en cellules progénitrices intermédiaires spécifiques au cerveau (IPC) et en cellules précurseurs (Prec2), se développant finalement en neurones glutamatergiques corticaux (Glu1 et Glu4). De plus, les Sp-RG dans l'éminence ganglionnaire (GE) progressent vers des neurones GABAergiques dans le cortex.

De plus, les cellules gliales radiales dans le diencéphale (Dien RG-1) ont tendance à se différencier en neurones GABAergiques LHX6+, tandis que Dien RG-2 est orienté vers le développement de neurones glutamatergiques. Les résultats de visualisation spatiale montrent que Dien RG-1 et les neurones GABAergiques LHX6+ sont principalement situés dans la région ventrale du diencéphale, tandis que Dien RG-2 et les neurones glutamatergiques diencéphaliques se trouvent principalement dans la région dorsale. Cette distribution spatiale corrobore davantage les résultats issus de l'analyse des données à cellule unique.

En résumé, la troisième stratégie de recherche a été utilisée pour explorer le développement de sous-types neuronaux spécifiques à travers différentes régions cérébrales grâce à une analyse spatiale du pseudo-temps.

Figure 5 : Analyse de la distribution spatiale en pseudo-temps des sous-populations de cellules cibles

Enfin, les auteurs ont réalisé une analyse de communication cellulaire pour étudier les interactions entre les cellules gliales et les neurones GABAergiques. Il a été observé que les gènes associés aux ligands NCAM1 et NRXN1 présentaient des niveaux d'expression élevés dans les cellules précurseurs oligodendrocytaires précoces (OPC-1) et GABA-7, tandis que les gènes associés aux récepteurs L1CAM et NLGN1 étaient enrichis dans GABA-7 et les OPC-1 précoces, respectivement (voir Figure 4A). Ces interactions ont été principalement identifiées au sein du diencéphale ventral (DV).

De plus, l'analyse a révélé des interactions entre les cellules gliales et les neurones d'autres régions. Les OPC-2 précoces ont été localisés à la frontière entre le cortex (Cor) et le subpallium (Sp), tandis que les neurones glutamatergiques Glu1 et Glu4 sécrétaient le ligand NRG1, qui attirait les OPC à migrer vers le cortex.

En résumé, la quatrième stratégie de recherche a été utilisée pour élucider les interactions entre les cellules gliales et les neurones, ainsi que pour caractériser les préférences de distribution spatiale des cellules gliales au cours du processus de développement.

Figure 6 : Distribution spatiale et interactions des cellules gliales

Étude de cas deux

Dans une étude publiée dans Découverte de cellules (Impact Factor = 33,5) en 2024, les auteurs ont réalisé une analyse multi-omique spatiale à cellule unique du cervelet humain. L'enquête a identifié des lignées GABAergiques, telles que les interneurones et les cellules de Purkinje (PKCs), ainsi que des lignées excitatrices, y compris les cellules en pince unipolaires (UBCs), les progéniteurs de cellules granulaires (GC) et les GC post-mitotiques.

L'analyse a révélé que l'abondance des PKC a atteint son pic à la semaine de gestation 13 (SG13) et a ensuite montré une forte diminution. Les données de transcriptomique spatiale ont indiqué une distribution multicouche et circonférentielle de différents types de cellules à SG13, correspondant à la couche granulaire externe externe (oEGL), la couche granulaire externe interne (iEGL), la zone intermédiaire (IZ) et la zone ventriculaire (VZ). À la semaine de gestation 16 (SG16), des séparations notables de la lèvre rhombique (RL), de la couche granulaire externe (EGL) et de la couche de cellules de Purkinje (PCL) ont également été détectées.

En résumé, cette étude a utilisé la première stratégie de recherche pour examiner les caractéristiques de distribution spatiale des sous-populations cellulaires du cervelet.

Figure 7 : Carte transcriptomique temporelle et spatiale du développement cérébelleux humain

Dans l'analyse suivante, les auteurs ont utilisé l'analyse de pseudo-temps pour reconstruire la trajectoire de développement des lignées de cellules granulaires (CG). Les progéniteurs de cellules granulaires (PCG) ont été classés en deux populations distinctes : les PCG ATOH1+ (PCG+AT) et les PCG NEUROD1+ (PCG+ND). À la semaine de gestation 13 (SG13), les PCG+ND ont été observés sous les PCG+AT, montrant une séparation distincte entre l'intérieur et l'extérieur dans leur distribution.

Une analyse plus approfondie a impliqué la sélection de facteurs de transcription qui étaient enrichis dans les cellules progénitrices ou post-mitotiques pour l'analyse du réseau de régulation génique (GRN). Cette approche visait à identifier des gènes clés qui pourraient réguler les transitions d'état cellulaire pendant la différenciation des cellules germinales (GC). Il a été révélé qu'en plus de l'ATOH1, des facteurs de transcription tels que YBX3 et MEF2C pourraient également jouer des rôles dans le développement des GC.

En résumé, cette étude a utilisé les troisième et cinquième stratégies de recherche pour examiner la différenciation et les mécanismes régulateurs de la lignée GC.

Figure 8 : Distribution spatiale des lignées de cellules granulaires et réseau de régulation de la différenciation

Résumé

En conclusion, l'application combinée de la transcriptomique à cellule unique et de la transcriptomique spatiale facilite l'intégration des informations spatiales avec une résolution à cellule unique. Cette approche permet une exploration complète des caractéristiques de distribution des sous-populations cellulaires, de la différenciation développementale, des interactions et des mécanismes de régulation sous plusieurs dimensions.

Références :

1. Longo S K, Guo M G, Ji A L, et al. Intégration de la transcriptomique unicellulaire et spatiale pour élucider la dynamique intercellulaire des tissus. Nature Reviews Génétique, 2021, 22(10) : 627-644.
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3. Yang F, Zhao Z, Zhang D, et al. Analyse multi-omique à cellule unique du développement des lignées et de l'organisation spatiale dans le cervelet fœtal humain. Découverte des cellules, 2024, 10(1) : 22.