Séquençage d'ARN à cellule unique des micro-organismes

Le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) a été essentiel pour révéler des informations cruciales au sein des systèmes mammifères, enrichissant notre compréhension de la diversité transcriptionnelle à travers les types et états cellulaires. Il est tout aussi fondamental de découvrir l'hétérogénéité d'expression au niveau de la cellule unique chez les bactéries et les microbiomes.

Bien que le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) ait fait des progrès significatifs dans l'élucidation des complexités des cellules eucaryotes, y compris les plantes et les animaux, et soit devenu un pilier de la recherche biologique, la technologie scRNA-seq microbienne fait face à des défis redoutables. Ces obstacles incluent :

• Faible abondance d'ARNm : Le contenu en ARNm bactérien est remarquablement faible, environ deux ordres de grandeur inférieur à celui trouvé chez les mammifères.
• Absence de PolyA : Contrairement à leurs homologues eucaryotes, les ARNm bactériens ne possèdent pas la structure polyA à leur extrémité 3', rendant leur capture et leur analyse une tâche complexe.
• Demie-vie courte de l'ARNm : L'ARNm bactérien a une demi-vie nettement plus courte que l'ARNm des mammifères, nécessitant un traitement rapide et efficace.
• Épaisseur de la paroi cellulaire : Les cellules bactériennes possèdent des parois cellulaires plus épaisses, ce qui pose des obstacles à la lyse complète et à la libération efficace de l'ARNm pour l'analyse.
• Défis de la taille microbienne : La taille minuscule des cellules microbiennes complique l'isolement de cellules uniques pour l'analyse.

Ces dernières années, des scientifiques dévoués ont poursuivi des innovations techniques, aboutissant au développement de diverses méthodologies de séquençage d'ARN à cellule unique bactérienne, y compris microSPLIT et BacDrop.

Flux de travail de séquençage et d'analyse des cellules uniques pour les approches de séquençage des cellules uniques standard (non ciblées) et ciblées. (Woyke et al., 2017)

Séquençage d'ARN à cellule unique eucaryote (scRNA-seq)

Dans la recherche contemporaine, le scRNA-seq eucaryote a évolué en une technique largement utilisée, offrant une variété d'expériences, d'approches analytiques et plusieurs plateformes disponibles dans le commerce.

En utilisant un modèle d'infection par macrophages, le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) a révélé la polarisation rapide des cellules hôtes infectées par Salmonella, une observation qui avait échappé aux techniques de séquençage d'ARN en mélange. Cette analyse a également montré que les Salmonella en réplication active habitent principalement des macrophages M2 anti-inflammatoires et sensibles, tandis que les bactéries non réplicantes sont principalement localisées dans des macrophages M1 pro-inflammatoires. Il est à noter que le taux de réplication bactérienne est corrélé à l'ampleur de la réponse de l'interféron de l'hôte. L'intégration des données scRNA-seq avec les correspondantes Séquençage d'ARN dual des données ont établi un lien entre l'expression d'un facteur de virulence spécifique de Salmonella et la polarisation des macrophages. Salmonella manipule activement les cellules hôtes pour créer un environnement propice à la réplication, reflétant la stratégie de virulence de Mycobacterium tuberculosisCes ensembles de données unicellulaires représentent une ressource précieuse pour explorer l'hétérogénéité des différents types de cellules hôtes.

Une limitation de la scRNA-seq conventionnelle est sa dépendance à la poly(A) pour capturer les transcrits, ce qui entraîne la perte d'informations sur les transcrits dépourvus de queues poly(A), tels que les transcrits non codants. Pour relever ce défi, les chercheurs ont conçu une méthode basée sur les jonctions d'extrémité 3' appelée Small-seq, permettant la détection des miARN, des tARN et des snoARN dans des cellules uniques de mammifères. Une autre méthode, Holo-seq, examine à la fois les sARN et les ARNm au sein d'une seule cellule. Bien que l'état actuel de la biologie des infections tende vers des investigations axées sur les ARNm, les chercheurs portent de plus en plus leur attention sur les interactions impliquant des transcrits non codants entre les microbes et leurs hôtes. Par exemple, dans les cellules humaines infectées par Salmonella, les profils de lncRNA présentent des changements plus rapides que les ARNm, certains lncARN hôtes démontrant la capacité de réduire la susceptibilité à l'infection par Salmonella. De plus, certains sARN bactériens hautement conservés servent de régulateurs critiques, tandis que certains miARN contribuent à la défense de l'hôte contre les pathogènes, et d'autres sont activement exploités par Salmonella pour faciliter la pathogénie. L'étude des transcrits non codants dans les interactions hôte-microbe promet un développement futur.

Séquençage d'ARN à cellule unique bactérienne

Le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) chez les bactéries a rencontré d'importants défis techniques qui ont entravé son application généralisée chez les procaryotes. Ces obstacles incluent des facteurs tels que la petite taille des cellules, la séparation complexe des cellules, la présence de parois cellulaires rigides et l'absence de queues polyA sur les molécules d'ARNm. En conséquence, l'adoption du scRNA-seq dans la recherche bactérienne en est encore à ses débuts.

Plusieurs nouvelles technologies de détection des transcriptomes bactériens ont été développées pour relever ces défis. Parmi les méthodes notables, on trouve MATQ-seq, MicroSPLiT, PETRI-seq, scDual-seq et la technologie PatH-Cap. En particulier, scDual-seq et PatH-Cap ont été spécifiquement conçues pour la détection des bactéries intracellulaires. Par exemple, des scientifiques ont utilisé MATQ-seq pour analyser Salmonella typhimurium et Pseudomonas aeruginosa Après avoir isolé les cellules, une analyse comparative avec des données de séquençage RNA-seq en mélange traditionnel a révélé que le MATQ-seq excelle dans la capture précise des motifs d'expression des gènes dépendants de la croissance.

Amélioration du flux de travail MATQ-seq pour le séquençage d'ARN unicellulaire bactérien. (Homberger et al., 2023)

Dans une autre étude, le PETRI-seq a été utilisé pour étudier E. coli et Staphylococcus aureus, capturant environ 200-300 ARNm par bactérie. Pendant ce temps, le microSPLiT a été appliqué à des individus. Bacillus subtilis et E. coli des cellules, détectant en moyenne plus de 300 copies d'ARNm par bactérie. Bien que ces méthodes aient permis le séquençage du transcriptome de bactéries individuelles, elles restent en deçà de leurs homologues eucaryotes en termes de débit cellulaire, de taux de capture d'ARNm/gènes et de profondeur de séquençage des gènes.

Le domaine du séquençage d'ARN à cellule unique microbienne évolue rapidement, avec des technologies de séquençage d'ARN bactérien unique pour les espèces à Gram négatif et à Gram positif qui émergent encore. Bien que la phase de preuve de concept soit presque terminée, la prochaine frontière consiste à étudier des communautés microbiennes naturelles où des bactéries individuelles peuvent ne posséder qu'un nombre limité d'ARNm, ne dépassant souvent pas quelques centaines. Pour faire avancer ce domaine, il est essentiel de développer des techniques de lyse et d'élimination de l'ARNr efficaces pour les bactéries individuelles en utilisant des protocoles basés sur CRISPR. De plus, le développement de dispositifs basés sur la microfluidique pour simplifier la manipulation des échantillons est crucial.

Les communautés microbiennes peuvent présenter une organisation spatiale définie avec des fonctions spécifiques tant dans des états sains que malades, nécessitant l'intégration du scRNA-seq avec des techniques d'imagerie avancées pour déchiffrer ces relations. Enfin, comprendre les rôles des sous-groupes microbiens au fil du temps et dans différents contextes spatiaux sera essentiel pour concevoir des interventions thérapeutiques ciblées.

Références :

1. Homberger, Christina, et al. "Amélioration du RNA-seq à cellule unique bactérienne grâce à un MATQ-seq automatisé et à l'élimination des lectures d'ARNr basée sur Cas9." Mbio 14.2 (2023) : e03557-22.
2. Woyke, Tanja, Devin FR Doud, et Frederik Schulz. "La trajectoire du séquençage de cellules uniques microbiennes." Méthodes de la nature 14.11 (2017) : 1045-1054.