Un guide complet des technologies de typage moléculaire HLA : des méthodes basées sur la PCR à la NGS

Dans le domaine de la recherche croisée entre la médecine moderne et l'immunologie, l'innovation itérative de Typage des antigènes leucocytaires humains (HLA) La technologie continue de promouvoir le développement de la médecine de précision. En tant que pont important entre le polymorphisme génétique et le mécanisme de régulation de la réponse immunitaire, le typage HLA joue un rôle de soutien central dans l'appariement donneur-receveur pour la transplantation d'organes et la recherche sur la pathogénie des maladies auto-immunes.

Comparé à la méthode traditionnelle de typage sérologique basée sur la reconnaissance spécifique des anticorps, la technologie de typage moléculaire HLA a réalisé un changement de paradigme, passant de l'analyse du phénotype antigénique à l'identification précise du génotype grâce à une analyse approfondie de la séquence nucléotidique des loci HLA. Cette avancée technique a considérablement amélioré la résolution du typage HLA et établi un nouveau cadre de recherche dans les domaines de la découverte d'allèles rares, de la prédiction du rejet de greffe et de l'évaluation du pronostic.

Cet article présente de manière exhaustive la technologie de typage moléculaire HLA, allant de la méthode basée sur la PCR à la NGS, et analyse et compare les technologies principales ainsi que le choix technologique en fonction des besoins.

Qu'est-ce que le typage HLA moléculaire ?

Le typage HLA moléculaire, c'est-à-dire le typage HLA au niveau moléculaire, fait référence à la méthode de détection directe de la séquence nucléotidique du gène HLA par la technologie de biologie moléculaire, afin de déterminer le type d'allèle HLA des individus. En tant que composant central du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC), l'HLA est hautement polymorphe, en particulier HLA-A, HLA-B et HLA-DRB1, et le nombre d'allèles a atteint des milliers. Le cœur du typage HLA moléculaire est d'analyser le polymorphisme du gène HLA au niveau de l'ADN, ce qui fournit une base moléculaire pour la médecine de précision et la recherche liée à l'immunité.

Structure des molécules HLA de classe I et de classe II (Deshpande, 2017)

Différence par rapport aux méthodes sérologiques traditionnelles

Le typage HLA traditionnel repose principalement sur des méthodes sérologiques, qui classifient les antigènes HLA à la surface des cellules par des anticorps. Cependant, les méthodes sérologiques présentent des limitations évidentes.

• Résolution faible : Les méthodes sérologiques ne peuvent identifier que le niveau de spécificité des antigènes, mais ne peuvent pas distinguer les allèles ayant des séquences d'acides aminés très similaires, ce qui rend difficile de répondre aux besoins de typage à haute résolution en clinique.
• Selon la qualité de l'antiserum : La préparation et la conservation de l'antiserum sont strictes, et il existe des différences entre les lots, ce qui peut entraîner des résultats de typage inexactes.
• Incapable de détecter de nouveaux allèles : Pour les nouveaux allèles HLA qui n'ont pas encore été découverts, les méthodes sérologiques ne peuvent pas les identifier en raison de l'absence d'anticorps correspondants.

En revanche, le typage moléculaire HLA présente des avantages évidents :

• Basé sur la détection de l'ADN : La séquence du gène HLA est directement analysée, ce qui évite l'influence de l'expression anormale des antigènes de surface cellulaire sur les résultats du typage.
• Saisie haute résolution : elle peut être précise au niveau des allèles, même distinguer des allèles avec seulement une différence de nucléotide, et fournir une base de correspondance plus précise pour des applications cliniques telles que la transplantation d'organes.
• Découverte de nouveaux allèles : Grâce aux techniques de biologie moléculaire, en particulier NGSde nouveaux allèles HLA peuvent être découverts et identifiés, et la base de données HLA sera continuellement enrichie.
• Le haut degré de standardisation : Le flux opérationnel et l'analyse des données de la technologie de typage moléculaire peuvent réaliser une standardisation, réduire l'interférence des facteurs humains et améliorer la répétabilité et la comparabilité des résultats.

Ambiguïtés alléliques du séquençage de nouvelle génération (NGS) par rapport à la sonde oligonucléotidique spécifique de séquence (SSOP) (Smith et al., 2019)

Comparaison des technologies de typage HLA moléculaire

Dans l'évolution de la technologie de typage HLA, le passage de la méthode sérologique à la méthode de biologie moléculaire marque un progrès significatif dans ce domaine. La technologie de typage moléculaire a construit un système technique diversifié avec des niveaux distincts et des fonctions complémentaires. Chaque méthode technique est basée sur les principes uniques de la biologie moléculaire et montre ses performances exceptionnelles dans l'application du génotypage HLA.

PCR-SSP

Basé sur l'amplification PCR de primers spécifiques à des allèles, le PCR-SSP a conçu des primers spécifiques dont l'extrémité 3' est strictement complémentaire à la séquence cible pour les sites de polymorphisme des gènes HLA. Lorsqu'il y a des allèles correspondants dans l'ADN modèle, les primers se lient précisément à l'ADN modèle et commencent l'amplification, entraînant des bandes spécifiques qui peuvent être détectées par électrophorèse. Son cœur technique réside dans la construction d'une bibliothèque combinatoire contenant des centaines de paires de primers spécifiques et la réalisation de la détection simultanée de plusieurs allèles par PCR multiplex.

A. Caractéristiques techniques

a) Opération simple et rapide : La saisie peut être effectuée en quelques heures sans étapes compliquées d'hybridation de sondes ou de séquençage.

b) Haute résolution : Elle peut atteindre le niveau de typage à résolution moyenne et est adaptée à la plupart des correspondances cliniques de routine.

c) Les exigences pour les conditions expérimentales sont faibles : des instruments PCR ordinaires peuvent le réaliser, ce qui est adapté aux laboratoires de base.

A. Limitations

a) La conception de primers est complexe : il est nécessaire de concevoir des primers spécifiques pour un grand nombre d'allèles HLA, et la bibliothèque de primers est énorme et le coût est élevé.

b) Les allèles inconnus ne peuvent pas être détectés : seuls les allèles connus peuvent être détectés, et il n'y a rien à faire avec les allèles nouvellement découverts.

c) La résolution des hétérozygotes est limitée : pour des échantillons hétérozygotes complexes, une inhibition de la compétition des amorces peut se produire, entraînant des résultats de typage inexacts.

Nombre d'ambiguïtés pour le typage HLA-A pour les exons 1 à 5 (HDkit/XRkit) (Bouthemy et al., 2018)

PCR-SSO

La technologie PCR-SSO amplifie d'abord la région cible du gène HLA par PCR, puis hybridise le produit amplifié avec une sonde oligonucléotidique spécifique de séquence (SSO) immobilisée sur une membrane ou une puce. En fonction de l'existence et de l'intensité du signal d'hybridation, le type d'allèle HLA est déterminé.

A. Caractéristiques techniques

a) Haute résolution : Un typage à haute résolution peut être réalisé, en particulier pour le typage des gènes HLA-II.

b) Flux élevé : Plusieurs loci et allèles peuvent être détectés simultanément par la technologie des puces.

c) Les résultats peuvent être quantifiés : L'intensité du signal d'hybridation peut refléter l'abondance de la séquence cible, ce qui aide à analyser les échantillons hétérozygotes.

B. Limitations

a) Les étapes de l'opération sont compliquées : l'amplification par PCR, l'hybridation, le lavage de la membrane et la détection du signal sont nécessaires, ce qui prend beaucoup de temps.

b) Sensible aux conditions expérimentales : de légers changements de température d'hybridation et de concentration en sel peuvent affecter les résultats d'hybridation.

c) Il est difficile de maintenir la bibliothèque de sondes : avec l'augmentation du nombre d'allèles HLA, la bibliothèque de sondes doit être mise à jour en permanence, et le coût est élevé.

Nombre d'ambiguïtés d'allèles nuls pour le typage HLA-A, HLA-B et HLA-DRB1 (Bouthemy et al., 2018)

Séquençage de Sanger

Séquençage de Sanger est une technologie de séquençage de l'ADN basée sur la méthode de terminaison de chaîne par didésoxy, qui détermine le type d'allèle en lisant la séquence de nucléotides du gène HLA. Pour le typage HLA, le séquençage de Sanger est généralement utilisé après une amplification ciblée, c'est-à-dire que l'exon cible du gène HLA est d'abord amplifié par PCR, puis les produits amplifiés sont séquencés dans les deux directions.

A. Caractéristiques techniques

a) Méthode de référence : Le séquençage de Sanger était autrefois la méthode de référence pour le typage HLA, avec une grande précision et fiabilité.

b) Séquence de lecture directe : La séquence de nucléotides du gène HLA peut être obtenue directement, ce qui fournit la preuve la plus directe pour l'identification des allèles.

c) Adapté à l'identification de nouveaux allèles : De nouveaux allèles HLA peuvent être découverts et identifiés.

B. Limitations

a) Faible flux : Un séquençage ne peut analyser qu'un seul fragment d'un échantillon, ce qui ne peut pas répondre aux exigences de typage quantitatif de Qualcomm.

b) Coût élevé : Le coût des réactions de séquençage et des réactifs est élevé, en particulier pour la détection de plusieurs sites et exons.

c) Analyse complexe des données : Pour les sous-échantillons hétérozygotes, il est chronophage et laborieux de découper et d'analyser manuellement la séquence.

Temps et effort pour les workflows de séquençage de nouvelle génération (NGS) et de sondes oligonucléotidiques spécifiques à la séquence (SSOP) (Smith et al., 2019)

NGS

technologie NGS, également connue sous le nom de technologie de séquençage de nouvelle génération, peut séquencer simultanément un grand nombre de fragments de gènes HLA grâce au séquençage parallèle à grande échelle. Pour le typage HLA, une capture ciblée ou une PCR multiplex est généralement utilisée pour amplifier tous les exons ou les séquences complètes des gènes HLA, puis le séquençage à haut débit est utilisé pour comparer les lectures de séquençage à la base de données de référence HLA à travers analyse bioinformatiqueafin de déterminer le type d'allèle.

A. Caractéristiques techniques

a) Montant Qualcomm : Un séquençage peut compléter le typage de plusieurs loci HLA de plusieurs échantillons, ce qui améliore considérablement l'efficacité de détection.

b) Haute résolution : l'analyse de la séquence complète des gènes HLA peut être réalisée, atteignant le niveau de typage haute résolution et même d'analyse des haplotypes.

c) Couverture complète : elle peut détecter tous les exons du gène HLA, y compris les régions hautement polymorphes, et éviter de manquer des sites polymorphes importants.

d) Découverte de nouveaux allèles : Grâce au séquençage impartial, de nouveaux allèles HLA peuvent être découverts et identifiés de manière efficace, et la mise à jour de la base de données HLA peut être encouragée.

B. Limitations

a) Exigences élevées en matière d'équipement et de technologie : un équipement NGS professionnel et une plateforme d'analyse bioinformatique sont nécessaires, ainsi que des exigences élevées pour les conditions de laboratoire et la technologie du personnel.

b) Analyse de données complexes : les données de séquençage massives nécessitent des processus bioinformatiques complexes pour être analysées, y compris l'alignement des séquences, l'allocation des allèles, etc., ce qui requiert des ressources informatiques élevées et des algorithmes.

c) Coût plus élevé : Bien que le coût du séquençage unique diminue avec le développement de la technologie, le coût de l'investissement en équipement et de l'analyse des données au début reste encore élevé.

Comparaison des méthodes courantes de typage HLA (Shahrabi et al., 2019)

Avantages du séquençage de nouvelle génération (NGS) dans le typage moléculaire HLA

Dans le domaine du typage HLA à haute résolution, la technologie NGS redéfinit le paradigme de détection grâce à ses avantages uniques. Elle permet une couverture complète des gènes HLA grâce au séquençage parallèle Qualcomm, peut analyser avec précision des hétérozygotes complexes, améliore significativement le taux de détection des allèles rares, fournit des données haplotypiques précises pour le couplage de transplantation et la recherche sur les associations avec les maladies, et fait progresser le typage HLA d'une résolution moyenne à une identification précise des allèles.

Couverture Génétique Complète

Les techniques traditionnelles de typage HLA, telles que PCR-SSP et PCR-SSO, ne détectent généralement que certaines régions hautement polymorphes des gènes HLA et peuvent manquer des sites polymorphes dans d'autres régions. La technologie NGS peut couvrir tous les exons ou les séquences complètes des gènes HLA grâce à une capture ciblée ou à une amplification PCR multiplex. Les avantages de cette couverture complète des gènes sont :

• Évitez d'omettre des sites polymorphiques importants : Le polymorphisme du gène HLA n'existe pas seulement dans la région classique de la fente de liaison des antigènes, mais peut également être réparti dans d'autres régions. Le polymorphisme de ces régions peut affecter l'expression et la stabilité des molécules HLA ou l'interaction avec d'autres molécules, affectant ainsi la réponse immunitaire. Une couverture complète du gène peut garantir que tous les sites polymorphiques susceptibles d'affecter la fonction HLA sont détectés.
• Analyse précise des allèles complexes : Certains allèles HLA peuvent présenter des combinaisons de mutations sur plusieurs loci, et ne détecter que certaines régions peut conduire à une identification erronée des allèles. Une couverture complète du gène peut fournir des informations de séquence complètes et garantir une analyse précise des allèles complexes.
• L'analyse des haplotypes est soutenue : les haplotypes HLA peuvent être déduits par séquençage complet de gènes et analyse bioinformatique, ce qui est d'une grande importance pour le matching en transplantation d'organes et la recherche sur l'association des maladies.

Distribution du nombre de lectures par échantillon et par locus (Liu et al., 2020)

Détection d'allèles rares

Le haut polymorphisme du gène HLA entraîne l'existence d'un grand nombre d'allèles rares, qui sont moins fréquents dans la population générale mais peuvent être plus courants dans une population ou une famille spécifique. Les techniques de typage traditionnelles ont souvent du mal à détecter les allèles rares en raison des limitations des amorces ou des bibliothèques de sondes, tandis que la technologie NGS présente des avantages évidents dans la détection des allèles rares :

• Séquençage impartial : La technologie NGS peut détecter les gènes HLA dans des échantillons sans connaître à l'avance la séquence des allèles grâce au séquençage à haut débit, afin de trouver et d'identifier des allèles rares.
• Haute sensibilité : La technologie NGS a une profondeur de séquençage élevée, peut détecter des allèles à faible fréquence et peut identifier avec précision l'existence d'allèles rares même dans des échantillons hétérozygotes.
• Promouvoir la mise à jour de la base de données HLA : La découverte et l'identification d'allèles rares contribueront à enrichir la base de données HLA et à fournir une norme de référence plus complète pour le typage HLA à travers le monde, en particulier pour l'étude des maladies rares et le matching de transplantation pour les personnes issues de minorités.

Comparaison inter-lots des pourcentages de lectures totales mappées à chaque locus (Liu et al., 2020)

Comment sélectionner la technologie appropriée

Avec le développement de la technologie de typage HLA, il est très important de choisir la méthode de séquençage appropriée pour obtenir des résultats de typage HLA précis et fiables. Différents objectifs de recherche, exigences de résolution, types d'échantillons, flux et considérations de coût influenceront tous le choix des méthodes de séquençage HLA.

Correspondance des méthodes de typage HLA et des types d'échantillons

La sélection des méthodes de séquençage HLA doit être basée sur le type d'échantillon. La différence de qualité, d'intégrité et de source de l'ADN des différents échantillons affecte directement l'applicabilité et la précision de la technologie de séquençage. Des échantillons de sang frais aux échantillons FFPE, en passant par l'ADN de haute qualité jusqu'aux échantillons micro-dégradés, une technologie de correspondance précise est nécessaire pour garantir la fiabilité et l'efficacité du typage HLA.

A. Sang frais

Le sang frais est l'un des types d'échantillons les plus couramment utilisés dans le typage HLA, riche en globules blancs et capable d'extraire de l'ADN de haute qualité, ce qui est adapté à de nombreuses méthodes de séquençage. Pour les échantillons de sang frais, la technologie NGS est le premier choix si des résultats de typage à haute résolution sont nécessaires. La qualité de l'ADN extrait du sang frais est élevée, ce qui peut répondre aux exigences de la technologie NGS en matière de qualité et de quantité d'ADN. Grâce à la NGS, un typage à haute résolution avec une couverture génétique complète peut être réalisé. Si la taille de l'échantillon est petite ou si le temps est urgent, le séquençage Sanger peut également être utilisé pour le typage HLA des échantillons de sang frais, en particulier pour l'analyse à haute résolution d'un échantillon unique.

B. ADN de faible qualité

Pour des échantillons d'ADN de faible qualité, tels que l'ADN extrait de traces de sang, de taches de sang séché ou d'autres sources, sa concentration et son intégrité peuvent être médiocres. À ce stade, la technologie PCR-SSP peut être plus appropriée, car elle nécessite une quantité relativement faible d'ADN, et en optimisant la conception des amorces et les conditions de PCR, l'efficacité d'amplification de l'ADN de faible qualité peut être améliorée. Si la technologie NGS doit être utilisée, il est nécessaire de prétraiter l'ADN de faible qualité, comme l'amplification du génome entier, mais cela peut introduire un biais et doit être pris en compte dans l'analyse des données.

Précision des trois outils pour le typage HLA à la résolution du deuxième champ ou du troisième champ pour différentes profondeurs et longueurs de lecture (Liu et al., 2021)

Recherche sur la corrélation des maladies

Dans l'étude de l'arthrite rhumatoïde (AR), la PCR-SSP traditionnelle ne peut détecter que la spécificité de l'antigène HLA-DR4, tandis que le séquençage de nouvelle génération (NGS) peut distinguer les sous-types HLA-DRB1*04:01/04:04. Les chercheurs ont utilisé le NGS pour séquencer l'ensemble du cluster de gènes HLA et ont découvert que HLA-DQB103:02 était indépendamment lié à la gravité de la maladie (OR=1,32, IC à 95 % 1,17-1,49), à l'exception de l'Épitope partagé classique. Le lien haplotypique de HLA-DRB1-DQA1-DQB1 a été analysé avec succès en utilisant la technologie de séquençage à long-lectures 10X Genomics, ce qui n'a pas pu être réalisé par la technologie à courtes lectures.

Accord de prédiction positive des sept algorithmes pour le typage HLA à différentes résolutions et gènes (Liu et al., 2021)

Conclusion

Le développement de la technologie de typage moléculaire HLA a connu une évolution passant des méthodes sérologiques traditionnelles aux techniques de biologie moléculaire. Actuellement, les technologies de typage moléculaire les plus courantes incluent PCR-SSP, PCR-SSO, séquençage Sanger et NGS. Chaque technologie a ses avantages et ses limites uniques. Dans l'application pratique, la technologie appropriée doit être sélectionnée en fonction des exigences spécifiques (telles que les exigences de résolution, la taille de l'échantillon, le temps et le coût, etc.).

Avec le développement continu de la technologie et la réduction des coûts, la technologie NGS sera de plus en plus utilisée dans le typage HLA. Parallèlement, combinée au développement de la bioinformatique et de l'intelligence artificielle, la précision et l'efficacité du typage HLA seront encore améliorées, fournissant un soutien technique plus solide pour la recherche et l'application clinique de la médecine de précision et des maladies liées au système immunitaire.

Références :

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