Aperçu du typage HLA basé sur le séquençage de nouvelle génération

Test HLA de haute résolution

Bien que le séquençage Sanger soit actuellement la méthode principale pour le typage HLA et soit utilisée dans les laboratoires de correspondance tissulaire HLA et les hôpitaux cliniques, son faible débit et son caractère chronophage sont les principaux inconvénients. De plus, l'isolement des séquences d'allèles HLA dans des spécimens hétérozygotes par séquençage de première génération nécessite également une approche plus complexe et coûteuse pour y parvenir. Le séquençage de nouvelle génération devient rapidement plus largement utilisé en raison de l'augmentation spectaculaire du débit et de la vitesse, ainsi que de la capacité à compléter des phases complètes. typage HLA haute résolution en une seule saisie.

La capture par hybridation basée sur le séquençage de nouvelle génération permet un typage HLA à haute résolution, à haut débit et à faible coût. La grande tolérance aux polymorphismes de séquence est un avantage remarquable de la capture par hybridation par rapport à l'enrichissement de séquence cible basé sur la PCR.

Avec le développement de la technologie moléculaire et l'amélioration des besoins médicaux modernes, la technologie de typage HLA a évolué d'un typage sérologique et cytologique avec une résolution et une précision inférieures vers un génotypage avec une résolution et une précision supérieures.

Il existe quatre typages HLA courants :

PCR-SSP (PCR avec des amorces spécifiques de séquence)

PCR-SSOP (PCR avec des sondes oligonucléotidiques spécifiques de séquence)

SBT (Typage basé sur le séquençage)

NGS (Typage basé sur le séquençage de nouvelle génération)

Application du séquençage de nouvelle génération dans le typage HLA

L'application du séquençage de nouvelle génération pour le typage HLA est divisée en 3 étapes : (1) séquençage et typage des régions polymorphes HLA ; (2) séquençage PCR à longue portée et typage de l'ensemble du gène HLA ou de l'ensemble des exons ; (3) séquençage en temps réel à molécule unique (SMRT) avec un avantage de longueur de lecture pour le séquençage et le typage directs des HLA-I et (ou) HLA-II. Les deux premières étapes sont réalisées par les systèmes 454, PGM et MiSeq/HiSeq, tandis que la troisième étape est principalement réalisée par le séquenceur SMRT de Pacific Biosciences.

Le système de séquençage 454 a d'abord été utilisé pour le typage HLA, et le principe est le séquençage par pyrophosphate. La longueur de lecture est passée de 100-150 pb à 700 pb, et son principal avantage est sa vitesse de séquençage rapide et sa longue longueur de lecture.

L'avantage de la longueur de lecture est essentiel pour produire des résultats précis et de haute résolution, et réduit considérablement les résultats incertains par rapport au SBT.

2. Le séquençage PGM est une technologie de séquençage de nouvelle génération à faible coût et rapide, mais sa courte longueur de lecture (environ 400 pb) rend l'analyse des données relativement difficile. D'après des études récentes, bien que limité par la longueur de lecture, le PGM peut tout de même obtenir des résultats de haute qualité en peu de temps, basé sur le typage après séquençage HLA en longueur complète ou le typage des exons polymorphes conventionnels par séquençage. Le problème urgent est d'améliorer ou de développer des logiciels de traitement des données pratiques.

3. Le système de séquençage MiSeq/HiSeq utilise une technologie de séquençage par terminaison réversible pour le séquençage par synthèse. Comparé à d'autres séquençages de nouvelle génération, le HiSeq est moins coûteux, a un débit plus élevé (600 Go/course) et séquence rapidement. Il est de loin supérieur à la méthode SBT en termes de débit, de rentabilité, de résolution et de vitesse de typage. Comparé au PGM, le MiSeq obtient un débit élevé, un faible taux d'erreur et un temps plus court.

4. SMRT présente l'avantage d'une vitesse rapide et d'une longue séquence de sortie, mais son taux d'erreur de séquençage est élevé.

Le séquenceur RSII lancé en avril 2013 a une longueur de lecture moyenne de 3000 pb, ce qui permet de réaliser un typage haute résolution et d'obtenir des séquences complètes des gènes HLA. À mesure que la technologie mûrit, SMRT pourrait également augmenter la longueur de lecture à 20 kb, ce qui pourrait résoudre correctement le problème d'ambiguïté dans le typage. Dans un avenir proche, la technologie SMRT révolutionnera la technologie de typage HLA basée sur le séquençage de nouvelle génération.

En termes de typage HLA, le système 454 a été utilisé en premier, le HiSeq d'Illumina, avec sa haute capacité de données et son coût économique, occupe une position importante dans le domaine. MiSeq/HiSeq et PGM sont actuellement les plateformes de typage par séquençage les plus largement utilisées, tandis que SMRT et le système 454 ont l'avantage des longues lectures, et SMRT a le potentiel de prendre le relais plus tard.

Flux de travail NGS à haut débit (PLoS ONE 11(10) 2016).

Caractéristiques du typage HLA basé sur la technologie de séquençage de nouvelle génération

En plus d'un débit élevé, d'un temps de cycle expérimental court et d'un faible coût, le typage HLA basé sur la technologie de séquençage de nouvelle génération présente les avantages suivants :

1. Résultats de saisie haute résolution

Le typage HLA à haute résolution est essentiel pour améliorer le succès de la transplantation et réduire l'incidence de la maladie du greffon contre l'hôte. Avant l'avènement du séquençage de nouvelle génération, il y avait deux façons d'obtenir des résultats à haute résolution : (1) après avoir obtenu des résultats de typage à basse résolution, sélectionner des sondes ou des amorces appropriées pour obtenir un typage à haute résolution ; (2) après le typage par la méthode SBT, confirmer les résultats incertains en utilisant les méthodes PCR-SSP ou PCR-SSO pour déterminer un typage précis et à haute résolution. La méthode de séquençage de nouvelle génération, qui est similaire à la méthode SBT, est la méthode de typage la plus précise et directe pour obtenir des résultats à haute résolution, et peut résoudre les résultats de typage HLA ambigus dans le typage SBT.

2. Résoudre le problème d'ambiguïté

Le pourcentage de résultats ambigus pour les HLA-A et B obtenus par la méthode SBT peut atteindre 76,31 % et 91,08 %, ce qui constitue un inconvénient majeur de la méthode SBT, considérée comme la référence en typage HLA. Il existe deux mécanismes générant des résultats ambigus : (1) l'ambiguïté de phase. Lorsque le siège du gène HLA de l'échantillon est hétérozygote, les séquences de différentes combinaisons d'allèles peuvent présenter les résultats de la même combinaison de typage. (2) Les séquences de bases de la région de détection conventionnelle sont identiques, et la diversité allélique se situe en dehors de la région de séquençage. Les solutions incluent l'utilisation de SBT avec PCR-SSO SSP, le séquençage de la région en dehors de la région de détection conventionnelle des HLA ou le séquençage après séparation des deux allèles, mais ces méthodes sont longues et laborieuses.

Le typage HLA basé sur le séquençage de nouvelle génération peut efficacement éviter ce problème : (1) la fragmentation des gènes amplifie et séquence des fragments d'ADN individuels, obtenant ainsi efficacement la phase de liaison du polymorphisme ; (2) le séquençage parallèle massif permet à chaque cycle de réaction de produire un grand nombre d'exons, d'introns et même de résultats de séquençage de gènes HLA entiers provenant de différents emplacements génétiques (ou de différents spécimens), ce qui peut être utilisé pour réaliser un typage précis.

De plus, à mesure que de nouveaux allèles sont découverts, la variété et la proportion de combinaisons de résultats ambigus augmenteront, ce qui stimulera également l'utilisation du séquençage de nouvelle génération pour le typage HLA.

3. Typage par séquençage de l'exome complet/du génome complet

Le typage par séquençage conventionnel se concentre sur les régions polymorphes des gènes HLA, c'est-à-dire les exons 2 et 3 des gènes de classe I HLA et l'exon 2 des gènes de classe II HLA. Pour des raisons de coût et techniques, seulement environ 10 % des gènes nommés dans la base de données IMGT/HLA ont des séquences complètes de gènes HLA.

Avec la maturation des méthodes de typage HLA par séquençage de nouvelle génération et la réduction des coûts de séquençage, le typage par séquençage de l'exome ou du génome entier HLA a été de plus en plus rapporté. Cette méthode est bénéfique pour la découverte de nouveaux allèles HLA, la résolution des ambiguïtés et l'obtention d'une ultra-haute résolution, ce qui peut enrichir les données de la base de données IMGT/HLA et de la transplantation de moelle osseuse, faciliter l'étude du polymorphisme HLA et de l'évolution moléculaire dans la population, et fournir un grand confort pour les futures recherches scientifiques et le travail clinique.

Les limites du typage HLA par séquençage de nouvelle génération

Cependant, avant que cette application ne soit popularisée, les obstacles suivants demeurent : (1) bien que la performance de la méthode de séquençage de nouvelle génération se soit considérablement améliorée par rapport à d'autres méthodes, il s'agit sans aucun doute d'un projet laborieux, matériel et financier pour obtenir un séquençage du génome entier HLA à grande échelle ; (2) les spécifications opérationnelles du typage par séquençage du génome entier ou du whole-exome HLA par séquençage de nouvelle génération doivent être progressivement améliorées ; (3) le typage par séquençage du génome entier est voué à découvrir un grand nombre de nouveaux allèles HLA, et des questions telles que leur nomination et confirmation ainsi que l'intégration et le partage d'informations massives doivent être prises en compte.

L'émergence de nouvelles technologies, avec des avantages évidents, présente également certaines limitations. Les lacunes du typage HLA par séquençage de nouvelle génération résident principalement dans : (1) la courte longueur des lectures, qui constitue le principal goulot d'étranglement de la technologie de séquençage de nouvelle génération et entraîne certaines difficultés pour l'assemblage ultérieur du génome, il est réjouissant que la longueur des lectures SMRT puisse encore être réalisée efficacement pour le typage HLA ; (2) des exigences élevées en matière d'analyse de données et de logiciels, une série de logiciels de traitement de données excellents a émergé en conséquence, tels que Omixon Target HLAE201, NGSengine, HLAreporter, Op-tiType, etc.

Conclusion

En tant que technologie classique de génotypage HLA, le PCR-SBT/SSP/SSO reste la méthode dominante à l'international, mais le typage HLA par séquençage de nouvelle génération présente des avantages évidents en termes de haut débit, de haute résolution, de résolution des résultats de typage ambigus et de découverte de nouveaux allèles. Avec le développement de la technologie et la popularisation de l'application, des expériences de contrôle sur de grands échantillons sous différentes plateformes de séquençage de nouvelle génération ; l'amélioration du système de nommage et l'établissement d'une plateforme de partage d'informations ; le développement et l'évaluation de logiciels de traitement des données ainsi que l'élaboration de protocoles d'opération standardisés méritent une attention particulière dans les recherches futures. En raison de la complexité des molécules HLA, la description de la diversité HLA dans la population et l'exploration des mécanismes évolutifs semblent relativement difficiles. Les études de typage HLA basées sur le séquençage de nouvelle génération facilitent l'établissement de bibliothèques de moelle osseuse à grande échelle, le travail de correspondance à haute efficacité et l'étude de la structure des gènes HLA et de leur fonction moléculaire, ce qui conduira au développement ultérieur de la recherche et des applications HLA.

Références :

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