Typage HLA : Introduction, Méthodes et Applications

Introduction au typage des antigènes leucocytaires humains

Les protéines du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) chez l'homme sont codées par le système HLA (antigène leucocytaire humain). Le système immunitaire humain est régulé par ces glycoprotéines qui font partie de la membrane cellulaire. Le CMH est divisé en deux classes : CMH de classe I et CMH de classe II. Le complexe génique HLA se trouve sur le chromosome 6p21 dans une région de 3,6 Mb. Avec plus de 10 000 allèles HLA différents identifiés à ce jour, ils constituent la famille de gènes la plus polymorphe du génome humain. En conséquence, la capacité à assembler une réponse immunitaire peut varier considérablement entre les individus d'une cohorte tirée d'une seule population. Le rejet de greffe, les maladies auto-immunes, la pharmacogénomique des vaccins, le cancer, les maladies infectieuses et la sélection de partenaires ont tous été liés aux gènes HLA.

Le génotypage HLA est le processus de détermination des polymorphismes des gènes HLA de classe I et de classe II d'un individu, ce qui est nécessaire pour le couplage de greffe et la recherche d'association avec des maladies. En raison du polymorphisme élevé dans diverses régions génomiques, le génotypage HLA sans ambiguïté est techniquement difficile. L'introduction du séquençage de nouvelle génération (NGS) a modifié le paysage du génotypage. Les méthodes traditionnelles de génotypage HLA et de séquençage Sanger ont des restrictions, et le génotypage HLA haute résolution utilisant la PCR et le NGS est distinctement capable de reconnaître ces limitations chez les patients. Cela permet une analyse fiable, simple, de haute qualité et à haut débit des principaux gènes HLA, avec des données phasées à au moins six chiffres. Un autre avantage est que, comme les cadres d'ADN sont constitués de molécules uniques, le problème de phasage est résolu.

Détection des anticorps HLA et ses applications

Des anticorps contre les HLA ont été découverts chez environ 20 % des femmes multipares et 30 % à 50 % des patients ayant reçu plusieurs transfusions. La méthode traditionnelle de cytotoxicité sérologique, la cytométrie en flux et la méthode en phase solide sont les trois principales approches pour détecter les anticorps HLA.

Méthode de cytotoxicité sérologique

Des billes magnétiques sont utilisées pour séparer les lymphocytes B du sang ou de la rate pour le typage HLA de classe II. Le typage HLA de classe I peut être effectué avec les leucocytes restants. Les lymphocytes sont ensuite placés dans des puits individuels sur des plaques Terasaki, qui contiennent divers anticorps spécifiques. Les cellules dans ce puits mourront si l'anticorps spécifique et l'antigène HLA se lient. Cette méthode ne peut pas faire la distinction entre les anticorps cytotoxiques HLA et non-HLA.

Cytométrie en flux

Des leucocytes fraîchement nucléés sont mélangés avec des anticorps monoclonaux marqués par fluorescence dans cette expérience. Les antigènes HLA de surface qui se lient aux anticorps fluorescent, permettant aux cytomètres en flux de les détecter alors qu'ils passent à travers un faisceau laser.

Technique en phase solide

La réaction est établie en utilisant des anticorps spécifiques FC conjugués à PE après que des billes de polystyrène teintées par fluorochrome, recouvertes d'antigènes HLA particuliers, ont été cultivées avec le sérum du patient. Bien que cette technique soit plus délicate que la cytotoxicité sérologique et l'ELISA, l'effet thérapeutique d'une sensibilité accrue reste à déterminer.

Détection du polymorphisme HLA et son flux de travail

Les méthodes basées sur l'ADN dominent dans les laboratoires de typage depuis l'avancement de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), en raison de leur précision et de leur reproductibilité, ainsi que de leur sensibilité et résolution accrues. Les amorces spécifiques de séquence PCR (SSP), les oligonucléotides spécifiques de séquence PCR (SSO), la PCR en temps réel, le typage basé sur le séquençage (SBT) et le séquençage de nouvelle génération (NGS) sont toutes des méthodes basées sur l'ADN.

En raison de sa précision, de son haut débit et de sa rapidité, le NGS, également connu sous le nom de séquençage à haut débit, devient progressivement la méthode préférée pour le typage HLA. Le principal avantage du NGS est qu'il élimine les ambiguïtés à un coût comparable à celui du SBT et sans avoir besoin de dépistages supplémentaires. La préparation de la bibliothèque d'ADN, l'amplification ciblée des gènes codant pour les peptides HLA à l'aide de PCR en émulsion ou en phase solide, le typage basé sur le séquençage de l'ADN et l'alignement des séquences contre des bases de données de banques de gènes, telles que le projet international ImMunoGeneTics/base de données HLA (IMGT/HLA), font tous partie du processus NGS. Le typage HLA basé sur le séquençage à haut débit est couramment utilisé dans le diagnostic clinique, le traitement et la médecine personnalisée.

Références :

1. Duke JL, Lind C, Mackiewicz K, et al. Détermination des caractéristiques de performance d'une méthode de typage HLA basée sur le NGS pour les applications cliniques. Hla. 2016, 87(3).
2. Carapito R, Radosavljevic M, Bahram S. Séquençage de nouvelle génération du locus HLA : méthodes et impacts sur le typage HLA, la génétique des populations et les études d'association avec des maladies. Human immunology. 2016, 77(11).
3. Gabriel C, Fürst D, Faé I, et al. Typage HLA par séquençage de nouvelle génération – se rapprocher de la réalité. Tissue antigens. 2014, 83(2).