Comment isoler l'ADN mitochondrial : Un guide complet

Les mitochondries, présentes dans presque toutes les cellules, sont des organites similaires à de petites centrales électriques qui génèrent l'énergie nécessaire au maintien des fonctions cellulaires de base. L'information génétique des mitochondries est stockée dans ADN mitochondrial L'ADN mitochondrial (ADNmt), qui se présente principalement sous forme de molécules circulaires, mais inclut également des molécules linéaires. Contrairement à l'ADN nucléaire, l'ADNmt est une molécule d'ADN double brin nue qui n'est pas protégée par des histones et se trouve à proximité des espèces réactives de l'oxygène. Ces facteurs, associés à la fidélité relativement faible des mécanismes de réplication et de réparation de l'ADN mitochondrial, entraînent un taux de mutation plus élevé que celui de l'ADN nucléaire. Au fil du temps, ce taux de mutation élevé a fait de l'ADNmt un indicateur important pour étudier les effets du stress environnemental et d'autres facteurs dommageables. L'extraction de l'ADN mitochondrial peut non seulement nous aider à explorer en profondeur la pathogenèse des maladies mitochondriales et fournir des indices clés pour développer des méthodes de traitement ciblées, mais aussi jouer un rôle important dans les domaines de la médecine légale, de l'anthropologie et d'autres domaines.

Méthodes traditionnelles d'isolement de l'ADN mitochondrial

1) Ultracentralisation du chlorure de césium

La chlorure de césium ultracentrifugation est une méthode classique et efficace pour extraire une haute pureté. ADN mitochondrial (mtADN). Cette technologie repose sur le principe de la centrifugation en gradient de densité au chlorure de césium et peut séparer efficacement les molécules d'ADN de différentes densités. Voici les étapes détaillées après optimisation, décrivant comment utiliser l'ultracentrifuge au chlorure de césium pour extraire l'ADNmt :

Matériaux et réactifs

Chlorure de césium (CsCl)
Bromure d'éthidium (EtBr) : Utilisé pour colorer l'ADN afin de faciliter son observation sous lumière ultraviolette.
tube à centrifuger
ultracentrifuge
lampe ultraviolette
Quantité appropriée de tampon (généralement tampon PBS ou tampon TE)
Réactif de digestion enzymatique (optionnel, pour la digestion de l'ADN non mitochondrial)

Étapes d'extraction

Lyse des cellules : Placez des cellules ou des échantillons de tissu dans un tampon de lyse approprié. Utilisez des méthodes mécaniques ou chimiques (telles que l'ultrason, les cycles de congélation-dégel ou l'utilisation d'agents de lyse) pour détruire les membranes cellulaires et libérer les mitochondries.
Centrifugation préliminaire : Éliminez les débris cellulaires et les cellules non disruptées par centrifugation à basse vitesse (environ 1000 g, 10 minutes).
Le surnageant a été collecté, contenant des mitochondries.
Préparation mitochondriale : Le surnageant a été centrifugé à grande vitesse (environ 10000 g, 15 minutes) pour précipiter les mitochondries.
Éliminez le surnageant et resuspendre le culot mitochondrial dans une petite quantité de tampon PBS ou TE.
Ajout de chlorure de césium et de colorant : Ajoutez du chlorure de césium et une petite quantité de bromure d'éthidium (EtBr) à la suspension mitochondriale. Le bromure d'éthidium se lie à l'ADN, rendant l'ADN visible sous lumière ultraviolette. Ajustez la densité du mélange pour vous assurer que l'ADN est correctement superposé dans le gradient de densité de chlorure de césium.
Ultracentrifugation : Transférez le mélange dans des tubes de centrifugeuse ultracentrifuge et centrifugez (environ 100 000 g ou plus, ce qui prend généralement plusieurs heures à une nuit). Pendant la centrifugation, l'ADN sera stratifié en fonction de sa densité, et l'ADN mitochondrial (ADNmt) et l'ADN nucléaire seront séparés en raison de leurs densités différentes.
Extraction d'ADN : Utilisez une lumière ultraviolette pour inspecter le tube de centrifugeuse et localiser la bande d'ADN lumineuse. Aspirez soigneusement les bandes contenant de l'ADNmt (généralement situées dans des zones plus claires car l'ADNmt est plus petit que l'ADN nucléaire). Transférez l'ADNmt extrait dans un nouveau récipient.
Purification de l'ADN : Utilisez la précipitation à l'alcool ou d'autres méthodes de purification de l'ADN pour éliminer le chlorure de césium et le bromure d'éthidium. Resuspendre l'ADN dans un tampon TE ou une autre solution appropriée.

2)Chromatographie sur colonne

L'extraction de l'ADN mitochondrial (ADNmt) par chromatographie sur colonne est une technique efficace de séparation de biomolécules qui repose sur l'interaction entre une phase stationnaire (matériau de la colonne) et une phase mobile (tampon) pour séparer différentes biomolécules. Cette méthode est particulièrement utile lors de l'extraction de l'ADNmt car elle réduit la contamination de l'ADN nucléaire et améliore la pureté de l'ADNmt. Voici les étapes pour extraire l'ADNmt en utilisant la chromatographie sur colonne, y compris les matériaux nécessaires et les détails de fonctionnement.

Matériaux et réactifs

Tampon de lyse : Contient généralement des tensioactifs non ioniques pour détruire les membranes cellulaires.
Colonne de chromatographie : Les matrices couramment utilisées sont le gel de silice ou la résine échangeuse d'ions.
Tampon d'élution : le pH et la concentration en sel sont ajustés pour optimiser l'élution de l'ADN.
Tube de centrifugeuse : Utilisé pour collecter les échantillons éludés.
Centrifuge : Utilisée pour les étapes de prélèvement d'échantillons et d'élution.
Tube à microcentrifugeuse : Utilisé pour collecter la solution finale d'ADN.
Éthanol ou isopropanol : Utilisé pour la précipitation de l'ADN.
Tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) : Utilisé pour dissoudre l'ADN purifié.

Étapes d'extraction

Lyse cellulaire : Mélangez les cellules ou tissus cibles avec un tampon de lyse. Lyse complètement les cellules et libérez les mitochondries par des moyens tels qu'un léger agitatement, des cycles de congélation-dégel, ou en utilisant des ultrasons.
Isolement mitochondrial : Éliminez les débris cellulaires et les grandes cellules non disruptées par centrifugation à basse vitesse (par exemple, 1 000 × g, 10 minutes).
Le surnageant est collecté et les mitochondries sont ensuite précipitées par centrifugation à haute vitesse (par exemple, 10 000 × g, 15 minutes). Le surnageant a été éliminé et les mitochondries précipitées ont été resuspendues dans une petite quantité de tampon de lyse.
Extraction d'ADN : Ajouter la quantité appropriée de tampon d'extraction d'acides nucléiques et de protéase K à la suspension mitochondriale pour digérer la protéine et libérer l'ADN. L'ADN a été extrait en utilisant la méthode phénol-chloroforme, puis précipité avec de l'éthanol ou de l'isopropanol.
Purification par chromatographie sur colonne : Resuspendre l'ADN précipité dans un tampon approprié et le charger dans une colonne de chromatographie sur colonne préalablement préparée. Éluant les substances adsorbées de manière non spécifique avec un tampon d'élution. Augmenter progressivement la concentration en sel dans le tampon d'élution pour éluer spécifiquement l'ADNmt. Collecter l'élutant, qui contient de l'ADNmt hautement pur.
Précipitation et resuspension de l'ADN : Ajouter 2,5 volumes d'éthanol à 100 % et 1/10 volumes d'acétate de sodium 3M à l'éluate, mélanger et placer à -20 °C pendant la nuit pour précipiter l'ADN. Après la précipitation par congélation, le précipité d'ADN est récupéré par centrifugation (par exemple, 12 000 × g, 30 minutes, 4 °C). Éliminer le surnageant, laver le précipité d'ADN au moins une fois avec de l'éthanol à 70 %, puis centrifuger pour récupérer l'ADN. Laisser sécher à l'air ou sécher brièvement sous vide le précipité d'ADN pour éviter un séchage complet, ce qui rend difficile la resuspension de l'ADN. L'ADN séché a été resuspendu dans une petite quantité de tampon TE, complètement dissous et stocké à -20 °C.

Méthode DNase

L'extraction de l'ADN nucléaire (ntDNA) par DNase est une technique efficace qui purifie l'ADN nucléaire en utilisant la DNase I, une enzyme qui clive spécifiquement l'ADN, pour digérer et éliminer l'ADN mitochondrial (mtDNA) ou d'autres ADN non ciblés dans un échantillon. Cette méthode est particulièrement adaptée aux expériences nécessitant un ADN nucléaire de haute pureté, telles que la recherche génomique au niveau des chromosomes ou les applications judiciaires. Voici les étapes détaillées pour extraire l'ADN nucléaire en utilisant la méthode DNase :

Matériaux et réactifs

DNase I : Une enzyme qui clive spécifiquement les brins simples et doubles d'ADN.
Tampon : Le tampon de réaction DNase I est généralement utilisé, et les composants spécifiques sont préparés selon les instructions de l'enzyme.
Tampon de lyse : Utilisé pour la lyse cellulaire et la libération de l'ADN.
Protéinase K : Utilisée pour la digestion des protéines afin d'assurer la libération de l'ADN.
Solution de phénol-chloroforme : Utilisée pour l'extraction et la purification de l'ADN.
Éthanol ou isopropanol : Utilisé pour la précipitation de l'ADN.
Tampon TE : Utilisé pour la resuspension de l'ADN.
Tubes de centrifugeuse et tubes de microcentrifugeuse : utilisés pour le traitement et la collecte d'échantillons.
Centrifuge : Utilisée pour diverses étapes de centrifugation.
Bain-marie à température contrôlée ou bloc chauffant : Utilisé pour contrôler la température de l'étape de traitement enzymatique.

Étapes d'extraction

Lyse cellulaire : Placez un échantillon de cellule ou de tissu dans un tube à centrifuger contenant un tampon de lyse. De la protéinase K, généralement à une concentration de 100 μg/mL, est ajoutée au tube à centrifuger pour digérer les protéines et libérer l'ADN. Les échantillons ont été incubés à 56°C pendant plusieurs heures ou toute la nuit pour lyser complètement les cellules.
Traitement par DNase I : Préparer la solution de DNase I : Préparez le tampon de réaction de DNase I selon les instructions du fabricant et ajoutez DNase I (généralement 1 à 10 unités/μg d'ADN). Ajoutez la solution de DNase I à l'échantillon lysé et mélangez bien. Incubez à 37°C pendant un temps approprié (généralement de 30 minutes à 1 heure) pour permettre à la DNase I de cliver complètement l'ADNmt. L'activité de la DNase I peut être arrêtée en ajoutant de l'EDTA à une concentration finale de 10 mM, ou par d'autres méthodes recommandées dans les instructions.
Extraction d'ADN : Ajoutez un volume égal de solution de phénol-chloroforme à l'échantillon traité, agitez-le complètement, puis centrifugez et superposez. Transférez soigneusement la phase aqueuse contenant l'ADN dans un nouveau tube de centrifugation. Répétez l'étape d'extraction au phénol-chloroforme si nécessaire pour augmenter l'effet de purification.
Précipitation de l'ADN : Ajouter 0,1 volume d'acétate de sodium 3M et 2,5 volumes d'isopropanol à 100 % au surnageant. Après mélange, réfrigérer à -20 °C pendant la nuit pour favoriser la précipitation de l'ADN. Le lendemain, le précipité d'ADN est récupéré par centrifugation (par exemple, 12 000 × g, 30 minutes, 4 °C), le surnageant est éliminé et le précipité est lavé avec de l'éthanol à 70 %. Laisser sécher à l'air ou chauffer doucement jusqu'à ce que le précipité d'ADN soit juste sec pour éviter un dessèchement excessif, puis resuspendre l'ADN avec une quantité appropriée de tampon TE.

Procédure de lyse alcaline

La méthode de dénaturation alcaline est une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour extraire l'ADN mitochondrial (ADNmt), particulièrement adaptée aux expériences à petite échelle et à la recherche préliminaire. Cette méthode repose sur les caractéristiques de dissociation de l'ADN dans des conditions alcalines. L'ADNmt peut être efficacement libéré et purifié par un simple traitement alcalin, notamment lorsqu'il est extrait de cultures cellulaires ou d'un petit nombre d'échantillons de tissus. Voici les étapes détaillées pour extraire l'ADNmt en utilisant la méthode de dénaturation alcaline :

Matériaux et réactifs

NaOH (hydroxyde de sodium) : La concentration courante est de 50 mM.
EDTA : Concentration finale de 1 mM, utilisé pour chélater les ions métalliques et prévenir l'activité de la DNase.
Tris-HCl : Utilisé pour neutraliser les solutions d'ADN, pH 8,0, généralement à une concentration de 1M.
Éthanol glacé : Utilisé pour la précipitation de l'ADN.
Tampon TE : Pour la resuspension de l'ADN, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.
Tubes de microcentrifugeuse.
Centrifuge.
Mixeur vortex.
Bain-marie ou bloc chauffant : Utilisé pour chauffer des échantillons.

Étapes d'extraction

Préparation des échantillons : Collectez des échantillons de cellules ou de tissus dans des tubes de microcentrifugeuse. Ajoutez la quantité appropriée de tampon PBS et éliminez l'excès de tampon et les impuretés par centrifugation (3000 × g, 5 minutes).
Traitement alcalin : Ajouter un mélange de 50 mM de NaOH et 1 mM d'EDTA à l'échantillon, avec un volume d'environ 100-200 μL en fonction de la taille de l'échantillon. Après un bref mélange par vortex, l'échantillon a été chauffé dans un bain-marie à 95°C pendant 10-30 minutes pour permettre la libération complète de l'ADN.
Réaction de neutralisation : Retirez l'échantillon du bloc de chauffage et ajoutez immédiatement un volume égal de Tris-HCl 1M, pH 8,0 pour le neutraliser.
Après mélange, remuez brièvement et refroidissez rapidement à température ambiante.
Précipitation de l'ADN : Ajoutez 2 à 2,5 volumes d'éthanol glacé à l'échantillon neutralisé et mélangez bien.
Congelez le mélange à -20 °C pendant au moins 2 heures ou toute la nuit pour maximiser la précipitation de l'ADN.
Collecte d'ADN : Centrifugez l'échantillon à 12000 × g pendant 15 minutes à 4°C pour recueillir le précipité d'ADN. Le surnageant a été éliminé, le précipité d'ADN a été lavé avec de l'éthanol glacé à 70 %, et l'étape de centrifugation a été répétée. Éliminez à nouveau le surnageant et laissez sécher à l'air le précipité d'ADN pour éviter un dessèchement excessif.
Resuspendre l'ADN : Resuspendre le pellet d'ADN sec dans la quantité appropriée de tampon TE. Dissoudre complètement l'ADN en le faisant doucement tourner ou en le plaçant à température ambiante pendant plusieurs heures.

Technologie émergente d'isolement de l'ADN mitochondrial

Méthode de séparation par billes magnétiques

La méthode de séparation par billes magnétiques est une technologie innovante de séparation de l'ADN mitochondrial. Son mécanisme unique repose sur l'interaction de ligands spécifiques modifiés à la surface des billes magnétiques avec les mitochondries ou l'ADN mitochondrial. Les billes magnétiques sont généralement composées de matériaux magnétiques (tels que la magnétite ou l'oxyde de fer magnétique) avec une surface fonctionnelle modifiée avec des ligands pouvant se lier spécifiquement aux mitochondries ou à l'ADN mitochondrial. Ces ligands peuvent être des anticorps, des aptamères d'acides nucléiques, etc. Prenons l'exemple de billes magnétiques modifiées par des anticorps : les anticorps peuvent se lier spécifiquement à des protéines spécifiques à la surface des mitochondries. Lorsque des billes magnétiques sont ajoutées au lysat cellulaire, les anticorps à la surface des billes magnétiques reconnaissent et se lient à la protéine cible à la surface des mitochondries pour former un complexe bille magnétique-mitochondrie. Sous l'action d'un champ magnétique externe, le complexe bille magnétique-mitochondrie se déplacera vers le pôle magnétique et sera séparé des autres impuretés. De cette manière, les mitochondries peuvent être séparées des lysats cellulaires rapidement et efficacement. Si l'ADN mitochondrial doit être isolé directement, des billes magnétiques modifiées avec des aptamères d'acides nucléiques pouvant se lier spécifiquement à l'ADN mitochondrial peuvent être utilisées. Les aptamères peuvent se lier à des séquences spécifiques de l'ADN mitochondrial, permettant ainsi une capture sélective de l'ADN mitochondrial.

Méthode de séparation basée sur un kit

Les kits d'isolement de l'ADN mitochondrial couramment disponibles sur le marché ont leurs propres principes de fonctionnement et procédures d'utilisation. Les kits basés sur le principe de l'adsorption sur membrane en gel de silice sont largement utilisés. Prenons un certain marque de kit d'isolement de l'ADN mitochondrial comme exemple, son processus d'utilisation est le suivant : Tout d'abord, des échantillons cellulaires sont collectés et centrifugés pour éliminer le milieu de culture. Ensuite, on ajoute une quantité appropriée de tampon de lyse cellulaire, qui contient des ingrédients spéciaux capables de détruire les membranes cellulaires et de libérer le cytoplasme et les mitochondries. Les débris cellulaires et les grosses particules sont ensuite éliminés par une étape de centrifugation, et le lysat cellulaire est transféré dans une colonne de centrifugation contenant une membrane en gel de silice. Dans des conditions de haute salinité, l'ADN mitochondrial sera spécifiquement adsorbé sur la membrane en gel de silice, tandis que d'autres impuretés s'écouleront avec l'éluant. La membrane en gel de silice est ensuite lavée avec un tampon de lavage pour éliminer les impuretés résiduelles. Enfin, l'ADN mitochondrial adsorbé sur la membrane en gel de silice est élué avec un tampon d'élution à faible salinité. Ce kit basé sur l'adsorption sur membrane en gel de silice est relativement simple à utiliser, peut efficacement éliminer l'ADN nucléaire et d'autres polluants, et est adapté au traitement d'échantillons à grande échelle.

Figure 1. L'ADN cellulaire total est isolé à des fins de contrôle. (Quispe-Tintaya, W., et al., 2013)

Il existe plusieurs méthodes pour extraire l'ADN mitochondrial (ADNmt), notamment la centrifugation ultracentrifuge, la chromatographie sur colonne, le traitement par DNase et la dénaturation alcaline, chacune ayant ses propres avantages et inconvénients. La centrifugation ultracentrifuge offre une grande pureté mais une opération complexe, la chromatographie sur colonne réduit la contamination par l'ADN nucléaire, la méthode DNase améliore la pureté de l'ADN nucléaire, et la méthode de dénaturation alcaline est simple mais peut affecter l'intégrité. En tant que technologie émergente, la méthode de séparation par billes magnétiques présente les avantages de la rapidité et de l'efficacité. Choisir la bonne méthode est crucial pour l'exactitude de l'étude.

Référence :

1. Quispe-Tintaya, W., White, R. R., Popov, V. N., Vijg, J., & Maslov, A. Y. (2013). Isolement rapide de l'ADN mitochondrial à partir de cellules mammifères pour le séquençage de nouvelle génération. BioTechniques, 55(3), 133–136. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes.