Génome mitochondrial et séquençage de l'ADN mitochondrial (ADNmt)

Aperçu du génome mitochondrial

La mitochondrie est un organite indispensable pour presque toutes les cellules eucaryotes. Cependant, il existe quelques exceptions, comme les globules rouges matures. Le génome mitochondrial est une molécule circulaire à double brin d'environ 16 569 pb et code pour 37 gènes, y compris 22 ARNt, 2 ARNr et 13 protéines qui sont des sous-unités des complexes enzymatiques du système de phosphorylation oxydative. Par conséquent, le génome mitochondrial est très important pour l'énergie cellulaire et la survie. De plus, en raison de l'hérédité maternelle, l'ADNmt peut être utilisé pour retracer l'origine et l'ascendance des eucaryotes.

Figure 1. La structure du génome mitochondrial humain (tiré de Wiki).

• Génome mitochondrial et maladies humaines

Les mutations dans l'ADN mitochondrial (ADNmt) sont associées à une grande variété de maladies humaines telles que les maladies auto-immunes, le cancer et les troubles neurodégénératifs comme la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer. Mais pourquoi un génome si petit peut-il affecter la santé humaine à ce point ? Les chercheurs ont découvert que l'ADNmt est fortement soumis à des attaques mutagènes provenant des espèces réactives de l'oxygène, ce qui entraîne l'accumulation de mutations somatiques. Couplé à la capacité limitée de réparation des dommages à l'ADN dans l'organite, les altérations de l'ADNmt se produisent à un taux beaucoup plus élevé que celles de l'ADN nucléaire. De plus, les cellules eucaryotes peuvent contenir jusqu'à des milliers de mitochondries. L'hétéroplasmie de l'ADNmt est un indicateur de dysfonctionnement métabolique cellulaire. Par conséquent, une attention accrue a été portée à l'analyse du génome mitochondrial.

Séquençage de l'ADN mitochondrial

Séquençage de l'ADN mitochondrial est une approche puissante pour la détection des mutations de l'ADNmt associées aux maladies humaines, la détermination de l'hétéroplasmie de l'ADNmt, la détection des modifications épigénétiques et la classification des haplogroupes. Le séquençage de Sanger rend le séquençage de l'ADN mitochondrial facile et abordable. L'introduction des technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) est le plus grand changement dans la génomique mitochondriale. Le NGS peut générer des ordres de grandeur de données supplémentaires de manière moins coûteuse et plus rapide.

• Flux de travail du séquençage mitochondrial utilisant le NGS

Le flux de travail du séquençage de l'ADN mitochondrial comprend ces étapes : l'isolement de l'ADN génomique (contenant à la fois de l'ADN nucléaire et mitochondrial), l'enrichissement de l'ADNmt, la génération de bibliothèques, le séquençage à haut débit et l'analyse bioinformatique. L'ADNmt des échantillons d'ADN est amplifié individuellement en utilisant la méthode PCR à long rayon, avec deux fragments qui se chevauchent (>8 Kb). Il existe des kits commerciaux de PCR à long rayon disponibles sur le marché tels que le Qiagen LongRange PCR Kit et le SequalPrep™ Long PCR Kit avec dNTPs. La PCR à long rayon est une méthode flexible, efficace et économique pour séquencer des régions génomiques spécifiques, surtout lorsqu'elle est combinée avec des plateformes NGS. Cette méthode utilise des polymérases d'ADN à long rayon capables d'amplifier des séquences allant jusqu'à 15 Kb ou plus. Elle permet l'amplification de l'ensemble des chromosomes mitochondriaux. Après cette PCR, une électrophorèse sur gel d'agarose (0,7 %) est utilisée pour confirmer la présence du produit PCR, puis le produit PCR est quantifié. Des bibliothèques sont ensuite construites pour la fragmentation de l'ADN, la ligature d'adaptateurs avec codes-barres et l'amplification, suivies de la détermination de la concentration par qPCR et du séquençage avec Ion Torrent™ PGM™, Illumina HiSeq/MiSeq, d'autres plateformes NGS ou des plateformes de séquençage à longues lectures telles que PacBio RSII et Oxford nanopore MinION™.

• Analyse bioinformatique

Après le séquençage, la profondeur de couverture et d'autres paramètres sont estimés et la qualité des lectures est évaluée pour le filtrage et le rognage des lectures. L'alignement des séquences mitochondriales peut être effectué à l'aide de ClustalW, et les cadres de lecture ouverts (ORF) ainsi que les fragments de gènes d'ARNr peuvent être identifiés et annotés. Les mutations de séquence telles que les SNP sont détectées et leur fréquence allélique est estimée. L'association entre les mutations et les maladies humaines peut être prédite. De plus, la phylogénie animale peut être déduite en utilisant la méthode du Maximum de Vraisemblance ou l'Analyse Bayésienne.

Références

1. Smith D R. Le passé, le présent et l'avenir de la génomique mitochondriale : avons-nous séquencé suffisamment d'ADNmt ? Briefings en génomique fonctionnelle, 2015, 15(1) : 47-54.
2. Taanman J W. Le génome mitochondrial : structure, transcription, traduction et réplication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioénergétique, 1999, 1410(2) : 103-123.
3. Douglas A P, Vance D R, Kenny E M, et al.Séquençage de nouvelle génération du génome mitochondrial et association avec la néphropathie à IgA dans une population de greffe rénale. Rapports scientifiques, 2014, 4 : 7379.