Séquençage du Répertoire Immunitaire en Gros (TCR/BCR) : Principes et Applications

Tout au long de l'histoire humaine, le système immunitaire a représenté notre ligne de défense la plus redoutable contre les maladies. Au cœur de cette défense se trouvent les cellules T et les cellules B, qui fonctionnent comme les composants principaux de l'immunité adaptative. Ces cellules sont dotées de récepteurs spécialisés à leur surface.Récepteurs des cellules T (TCR) et les récepteurs des cellules B (BCRs) - qui leur permettent de reconnaître et de répondre aux pathogènes. Grâce au séquençage du répertoire immunitaire, ces récepteurs cruciaux peuvent être examinés en profondeur, fournissant des informations précieuses sur leur rôle dans le maintien de la santé et la lutte contre les maladies. En profilant la diversité et l'adaptabilité des TCRs et des BCRs, cette technologie offre un compréhension approfondie du système immunitaire stratégies, mettant en lumière les réponses immunitaires, les mécanismes de résistance aux maladies et les voies potentielles pour une intervention thérapeutique.

Que sont les TCR et les BCR ?

Les TCR et BCR constituent des composants moléculaires critiques du système immunitaire, situés principalement à la surface des cellules T et des cellules B, respectivement. Ces récepteurs jouent des rôles spécialisés dans la reconnaissance et la réponse à des antigènes spécifiques, formant ainsi une pierre angulaire de la réponse immunitaire.

Structure et composition des TCRs

Les TCR sont composés de deux chaînes polypeptidiques distinctes, typiquement une chaîne alpha (α) et une chaîne bêta (β). Cependant, dans certains sous-ensembles de cellules T, ces chaînes peuvent alternativement consister en variantes gamma (γ) et delta (δ). Chaque chaîne est caractérisée par la présence d'une région variable (V) et d'une région constante (C), la région variable étant principalement impliquée dans la reconnaissance des antigènes. Cette variabilité structurelle est cruciale, permettant aux TCR de se lier à une vaste gamme d'antigènes, un aspect fondamental de l'immunité adaptative.

Structure et composition des BCRs

En revanche, les BCR sont des immunoglobulines membranaires (mIg) exprimées à la surface des cellules B. Ces récepteurs peuvent exister sous cinq formes isotypiques : IgM, IgD, IgG, IgA et IgE. Chaque BCR est structuré avec deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques, formant une configuration en forme de Y. Ce design structurel permet aux BCR de reconnaître efficacement une large gamme d'antigènes, jouant un rôle indispensable dans l'immunité humorale.

Figure 1. Structure et composition des TCR et BCR

Les rôles fonctionnels et les mécanismes des TCR et BCR dans le système immunitaire

Types de TCR et leurs rôles distincts

Il existe deux classes majeures de TCR : les TCR αβ et les TCR γδ. La majorité des cellules T expriment des TCR αβ, qui reconnaissent principalement des antigènes endogènes présentés par des molécules de classe I du CMH, y compris des fragments peptidiques dérivés de protéines virales ou associées aux tumeurs. En revanche, les TCR γδ se trouvent plus couramment dans des tissus spécifiques, tels que le tractus gastro-intestinal et la peau. Ces TCR γδ présentent des capacités uniques en reconnaissant des antigènes non peptidiques, tels que des lipides et des sous-produits métaboliques, jouant ainsi des rôles spécialisés dans certaines réponses immunitaires.

Fonction et activation du BCR

Contrairement aux TCR, les BCR reconnaissent et se lient directement aux antigènes libres indépendamment de l'implication des molécules MHC. La spécificité des BCR est hautement affinée ; chaque cellule B exprime un BCR unique capable d'identifier un antigène spécifique. Lorsqu'elle se lie à son antigène spécifique, la cellule B subit une activation, pouvant se différencier en cellule plasmique ou en cellule B mémoire. Les cellules plasmatiques activées produisent de grandes quantités d'anticorps, qui partagent le site de liaison à l'antigène avec le BCR original. Ces anticorps remplissent des fonctions critiques, y compris la neutralisation des antigènes et l'amélioration de l'élimination des antigènes du corps, soutenant ainsi les mécanismes de défense immunitaire adaptative.

Procédure expérimentale

Principe de la construction de bibliothèques d'immuno-répertoire d'ARN : codes-barres moléculaires et 5' RACE

La construction basée sur l'ARN bibliothèques d'immuno-répertoire L'utilisation de codes-barres moléculaires en conjonction avec l'amplification rapide des extrémités 5' de l'ADNc (5' RACE) permet un profilage à haute résolution de la diversité des récepteurs immunitaires. Cette méthodologie s'avère particulièrement efficace pour capturer l'abondance des transcrits natifs de l'ARN des immunoglobulines (Ig) et des récepteurs des cellules T (TCR), révélant ainsi des informations sur la diversité des séquences et les niveaux d'expression.

Course de 5' pour un profilage complet des récepteurs

La technique 5' RACE est largement utilisée pour capturer les régions variables (V) complètes des transcrits d'Ig et de TCR à partir de leurs extrémités 5'. Cette méthodologie commence par une transcription inverse, où un amorce spécifique s'anneale à la région constante (C) du transcrit, facilitant la synthèse de l'ADN complémentaire (cDNA). Les étapes procédurales suivantes impliquent la capture et l'amplification de l'extrémité 5', permettant aux chercheurs de récupérer la région V complète, ce qui est essentiel pour comprendre la diversité de liaison aux antigènes des récepteurs immunitaires. Cette technique est particulièrement avantageuse car elle capture le point de départ naturel du transcrit, garantissant une représentation plus précise de l'architecture de la région VDJ.

Codes barres moléculaires pour réduire le biais d'amplification

L'incorporation de codes-barres moléculaires - de courtes séquences nucléotidiques aléatoires ajoutées à chaque molécule d'ARN avant l'amplification - joue un rôle essentiel dans le contrôle du biais d'amplification et la facilitation de la quantification de l'abondance des transcrits. Les codes-barres moléculaires sont intégrés lors de la phase initiale de transcription inverse, chaque molécule d'ARN étant marquée par une séquence distinctive. Au cours des processus d'amplification et de séquençage ultérieurs, ces codes-barres moléculaires permettent de différencier les molécules d'ARN originales des duplicatas PCR, permettant une évaluation précise de l'abondance des transcrits et réduisant les artefacts d'amplification. Cette étape est cruciale pour obtenir des informations quantitatives sur la diversité du répertoire immunitaire, permettant une normalisation fiable entre des transcrits disparates.

Utilisation combinée dans le séquençage à haut débit

Ensemble, les stratégies de 5' RACE et des codes-barres moléculaires favorisent une approche quantitative et à haut débit de l'ARN. profilage de l'immuno-répertoireAlors que la méthode 5' RACE garantit une capture complète de la région V des récepteurs immunitaires, les codes-barres moléculaires améliorent la précision dans la quantification des molécules d'ARN d'origine. Lorsqu'elles sont intégrées à des techniques de séquençage de nouvelle génération, ces méthodologies facilitent une caractérisation approfondie des répertoires immunitaires, fournissant des données essentielles pour la recherche en immunologie, le développement de vaccins et l'exploration des maladies liées au système immunitaire.

Figure 2. Principe de la construction de la bibliothèque d'immuno-répertoire d'ARN

Avantages et limitations de la construction de bibliothèques d'immuno-répertoire basées sur l'ARN

Sensibilité accrue : Les approches basées sur l'ARN offrent une sensibilité améliorée en raison de la présence de plusieurs copies d'ARNm par cellule, ce qui facilite l'amplification et l'intégration de codes-barres moléculaires.

Correction d'erreurs grâce aux codes-barres moléculaires : L'introduction de la technologie des codes-barres moléculaires aide à reconstruire l'état pré-amplification PCR, permettant ainsi de corriger les erreurs résultant des processus de PCR et de séquençage.

Capture de séquence complète avec 5' RACE : La méthode d'amplification rapide des extrémités de cDNA 5' (5' RACE) permet l'amplification de séquences de gènes de répertoire immunitaire en longueur complèteCette technique révèle non seulement de nouveaux gènes d'exons et des types de mutations, mais s'adapte également à divers formats de longueur de lecture de séquençage, permettant ainsi l'acquisition de séquences complètes de la région CDR3 ou de séquences complètes de TCR/BCR.

Exigence de qualité des échantillons : Cette méthode nécessite des échantillons de haute qualité pour obtenir des résultats précis et reproductibles.

Principe de la construction d'une bibliothèque d'immuno-répertoire basée sur l'ADN : Technologie de PCR multiplexe

La construction de bibliothèques d'immuno-répertoires basées sur l'ADN repose sur l'utilisation de la technologie de PCR multiplex, une méthodologie robuste capable d'amplifier simultanément plusieurs segments géniques au sein d'un cadre de réaction unique. Cette approche méthodologique est particulièrement avantageuse dans l'exploration des répertoires immunitaires, facilitant la capture exhaustive des segments géniques d'Ig et de TCR. Ces segments se caractérisent par une diversité considérable, conséquence d'événements de recombinaison et de mutation.

Dans la construction de bibliothèques d'immuno-répertoires, la PCR multiplex exploite des paires de primers soigneusement conçues, qui sont stratégiquement conçues pour cibler les régions variables, de diversité et de jonction (VDJ) des gènes d'Ig ou de TCR. Ces primers doivent présenter une haute spécificité pour permettre l'amplification d'un large éventail de combinaisons uniques de VDJ tout en réduisant simultanément l'amplification hors cible. Grâce à la conception précise des primers, cette technique réussit à encapsuler un large éventail de diversité des récepteurs immunitaires au sein d'un échantillon donné, un facteur critique pour des applications telles que le profilage immunitaire, la recherche sur les maladies et le développement thérapeutique.

De plus, au cours du processus d'amplification, des séquences de code-barres sont fréquemment intégrées dans les produits de PCR. Ces codes-barres facilitent la différenciation des échantillons individuels lors des phases de séquençage à haut débit ultérieures, permettant ainsi un suivi précis et une analyse comparative à travers de nombreuses bibliothèques. Cette étape s'avère particulièrement bénéfique dans les études à grande échelle en permettant le traitement parallèle d'un grand nombre d'échantillons. Par conséquent, elle réduit considérablement à la fois l'investissement temporel et financier tout en augmentant simultanément la profondeur de l'enquête analytique.

Figure 3. Principe de la construction de la bibliothèque d'immuno-répertoire ADN

Avantages et limitations de la construction de bibliothèques d'immuno-répertoires basées sur l'ADN

• Pertinence pour les échantillons dégradés : Les méthodes basées sur l'ADN sont bien adaptées aux échantillons où la qualité de l'ARN ne peut pas être maintenue de manière fiable, tels que les échantillons d'ARN dégradés ou les spécimens fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE).
• Capacité d'analyse quantitative : Les approches basées sur l'ADN permettent une analyse relativement quantitative des populations de lymphocytes, y compris les cellules T et B, puisque chaque copie de l'ADN génomique (ADNg) est directement corrélée à une seule cellule, fournissant une base un à un pour la quantification cellulaire.
• Amplification ciblée de la région CDR3 : Cette méthode amplifie principalement la région déterminante de la complémentarité 3 (CDR3), un segment crucial des gènes des immunoglobulines et des récepteurs des cellules T, responsable de la liaison et de la spécificité des antigènes.
• Exigences de qualité d'échantillon inférieures : La construction d'immuno-répertoires basée sur l'ADN nécessite une qualité d'échantillon inférieure par rapport aux méthodes basées sur l'ARN, facilitant ainsi la manipulation et l'analyse.

Applications de la recherche TCR/BCR en médecine de précision

L'analyse des antigènes spécifiques aux tumeurs sur les cellules cancéreuses dérivées des patients permet le développement de thérapies TCR-T (thérapie par cellules T transduites par récepteur des cellules T) personnalisées. Par exemple, la thérapie par cellules T TCR-T ciblant le mélanome a émergé comme une approche prometteuse en oncologie.

• TitreAnalyse fonctionnelle des TCR spécifiques de néoantigènes périphériques et intratumoraux identifiés chez un patient atteint de mélanome
• Journal: Journal de l'Immunothérapie du Cancer
• Facteur d'impact10,3
• Date de publicationseptembre 2021

Résumé

Une étude de cas sur le mélanome malin métastatique a été réalisée pour caractériser les réponses des lymphocytes T spécifiques aux néoantigènes dans le cadre de la régulation des points de contrôle immunitaire. Les chercheurs ont utilisé l'immunopéptidomique et la prédiction computationnelle pour identifier les néoantigènes, suivis de Séquençage TCR isoler les TCR spécifiques à ces néoantigènes du répertoire immunitaire du patient.

Des analyses multiparamétriques in vitro ultérieures - y compris des évaluations de l'affinité fonctionnelle, des tests de sécrétion de cytokines multiplex et un dépistage de la réactivité croisée - ont été utilisées pour évaluer l'efficacité antitumorale de ces TCR. Les ligands peptidiques mutés sélectionnés ont démontré un potentiel immunogène, affichant des affinités de liaison comparables à celles des complexes d'antigènes leucocytaires humains (HLA). Ces ligands peptidiques ont également montré des caractéristiques de liaison différentielles par rapport à leurs homologues de type sauvage dans des simulations de dynamique moléculaire.

Fait intéressant, les TCR reconnaissant ces néoantigènes ont montré des profils fonctionnels et de fréquence variés. Les TCR avec une affinité fonctionnelle comparativement plus faible ont affiché des réponses immunitaires antitumorales robustes in vivo, une découverte qui souligne l'efficacité potentielle de ces TCR malgré leur affinité modérée. De plus, ces TCR ont été détectés à des fréquences élevées, en particulier dans les tissus tumoraux, les ganglions lymphatiques et divers échantillons de sang, démontrant une persistance prolongée. Cette persistance s'aligne avec un schéma d'activation réduit qui suit la stimulation primaire in vitro, mettant en évidence le potentiel d'une efficacité antitumorale à long terme dans le microenvironnement tumoral.

Applications de l'immunothérapie

L'utilisation de la spécificité des TCR et des BCR a permis la conception d'anticorps bispécifiques innovants, tels que le Blinatumomab, ciblant des sous-types spécifiques de leucémie et aidant à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique pour diverses malignités.

• Titre Tislelizumab néoadjuvant associé à la radiothérapie stéréotaxique corporelle et Tislelizumab adjuvant dans le carcinome hépatocellulaire résécable à un stade précoce : l'essai de phase Ib Notable-HCC
• Journal: Communications Nature
• Facteur d'impact: 16,6
• Date de publicationavril 2024

Conception de l'étude

Cette enquête, un essai clinique de phase Ib à un seul centre et en ouvert (NCT05185531), a inclus 20 patients diagnostiqués avec un carcinome hépatocellulaire (CHC) de stade 0-A selon la classification du cancer du foie de Barcelone (BCLC). Les participants ont reçu trois sessions de radiothérapie corporelle stéréotaxique (SBRT) en combinaison avec deux cycles de thérapie par anticorps anti-PD-1 (tislelizumab) en néoadjuvant. Des échantillons de tissu tumoral et de sang périphérique ont été collectés avant et après l'intervention chirurgicale pour une évaluation pathologique, une immunohistochimie, Séquençage de l'ARN, et Séquençage des TCR.

Critères principaux

Les points clés comprenaient le délai chirurgical, la réponse tumorale radiologique et pathologique, ainsi que l'évaluation de la sécurité. Les résultats préliminaires ont indiqué une sécurité favorable et une efficacité antitumorale pour la combinaison de l'inhibition néoadjuvante de PD-1 et de la SBRT chez les patients atteints de CHC résécable à un stade précoce. De plus, le séquençage des TCR s'est avéré instrumental pour évaluer l'activation immunitaire après la thérapie néoadjuvante et éclaircir ses mécanismes.

Évaluation de l'efficacité de l'immunothérapie par Analyse du répertoire TCR

L'efficacité de l'immunothérapie par anticorps anti-PD-1 néoadjuvante a été évaluée en analysant les changements dans le répertoire des TCR avant et après le traitement. L'analyse post-traitement a révélé une augmentation substantielle de nouveaux clones de TCR, suggérant une réponse immunothérapeutique robuste. Le séquençage des TCR a identifié une présence significative de nouveaux clones de TCR à haute fréquence, soutenant davantage l'hypothèse selon laquelle le traitement néoadjuvant favorise des effets antitumoraux par l'expansion et le renouvellement des populations de cellules T spécifiques aux tumeurs.

Stratégies thérapeutiques pour les maladies auto-immunes

Les avancées dans l'analyse des motifs d'expression aberrante des récepteurs des cellules T (TCR) dans les maladies auto-immunes offrent des voies potentielles pour le développement d'agents thérapeutiques ciblant les TCR. Ces thérapeutiques sont conçues pour moduler l'activité des TCR, atténuant ainsi les réponses auto-immunes. Par exemple, des agents biologiques adaptés à des conditions telles que l'arthrite rhumatoïde illustrent cette approche.

• Titre: Analyse du répertoire des récepteurs B dans six maladies médiées par le système immunitaire
• Journal: Nature
• Facteur d'impact42,778
• Date de publicationseptembre 2019

Aperçu de l'étude

Cette étude a entrepris une analyse complète des répertoires de récepteurs des cellules B (BCR) à travers six maladies auto-immunes, en examinant spécifiquement les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de 209 patients atteints de lupus érythémateux systémique (LES), de vascularite associée aux anticorps anti-neutrophiles (ANCA), de la maladie de Crohn, de la maladie de Behçet, de la granulomatose éosinophilique avec polyangéite (EGPA) et de la vascularite à IgA. De plus, des échantillons de PBMC de 19 témoins sains ont été analysés. Les BCR au sein de ces échantillons ont été séquencés en utilisant la plateforme Illumina MiSeq avec des lectures en paires de 300 bp (PE 300).

Méthodologie

Pour garantir un séquençage de haute qualité des BCR, l'étude a mis en œuvre une approche de PCR multiplex utilisant des amorces conçues pour les régions V(D)J, complétées par des amorces universelles ciblant les régions constantes (C). Cette stratégie a permis une amplification robuste et la construction subséquente d'une bibliothèque de séquençage BCR complète. Les données obtenues ont facilité un cadre analytique multicouche, qui a examiné :

Influence de l'état de la maladie et de l'âge : Les associations entre les caractéristiques du BCR et l'état de la maladie ainsi que l'âge du patient ont été évaluées.

Distribution des sous-types d'anticorps : La variation des isotypes d'anticorps a été examinée dans différentes conditions pathologiques.

Utilisation des gènes IGHV : La fréquence d'utilisation des gènes variables lourds des immunoglobulines (IGHV) a été évaluée pour identifier d'éventuels schémas spécifiques à la maladie.

Longueur du CDR3 et diversité des clonotypes : Des analyses comparatives de la longueur de la région déterminante complémentaire 3 (CDR3) et de la diversité des clonotypes de BCR ont été réalisées pour élucider l'expansion clonale des cellules B spécifique à la maladie.

Changement de classe : Des modèles de commutation d'isotypes ont été étudiés pour comprendre les mécanismes d'adaptation immunitaire dans des contextes de maladie.

Variabilité longitudinale des BCR en réponse au traitement : Pour un sous-groupe de patients recevant des traitements spécifiques, l'évolution des répertoires de BCR a été surveillée afin de discerner les changements induits par le traitement.

Conclusions et implications

Cette étude fournit une caractérisation approfondie des répertoires de BCR dans les maladies auto-immunes, révélant des caractéristiques structurelles complexes et des variations associées aux états pathologiques. Ces informations apportent des connaissances précieuses sur les mécanismes pathogéniques sous-jacents aux maladies auto-immunes et ouvrent la voie à des stratégies thérapeutiques plus ciblées.

Conclusion

Lors d'une invasion pathogène, le système immunitaire de l'hôte mobilise une variété de cellules immunitaires, chacune caractérisée par des profils transcriptionnels distincts. Les antigènes sont reconnus par le récepteur des cellules B (BCR) sur les cellules B et le récepteur des cellules T (TCR) sur les cellules T, avec des sous-ensembles de ces cellules subissant une expansion clonale, formant des populations qui expriment des séquences BCR ou TCR identiques. Ce phénomène éclaire l'hétérogénéité multidimensionnelle de la réponse immunitaire face aux pathogènes. En analysant la diversité des séquences des BCR et des TCR, des informations peuvent être obtenues sur la distribution clonale au sein du microenvironnement immunitaire, faisant progresser la compréhension des mécanismes par lesquels l'organisme se défend contre l'invasion des pathogènes.

La technologie de séquençage des TCR démontre un potentiel significatif dans la recherche en immunothérapie. Elle facilite non seulement les avancées dans le domaine de la médecine personnalisée, mais revêt également une importance considérable dans la découverte et l'optimisation de nouvelles immunothérapies.

Références :

1. Bräunlein E, Lupoli G, Füchsl F, et al. Analyse fonctionnelle des TCR spécifiques de néoantigènes périphériques et intratumoraux identifiés chez un patient atteint de mélanome. J Immunother Cancer. 2021;9(9):e002754.
2. Bashford-Rogers RJM, Bergamaschi L, McKinney EF, et al. Analyse du répertoire des récepteurs des cellules B dans six maladies auto-immunes. Nature. 2019;574(7776):122-126.
3. Li, Z., Liu, J., Zhang, B. et al. Tislelizumab néoadjuvant associé à la radiothérapie stéréotaxique corporelle et tislelizumab adjuvant dans le carcinome hépatocellulaire résécable à un stade précoce : l'essai Notable-HCC de phase 1b. Nat Commun 15, 3260 (2024).