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Séquençage épigénomique : analyses de la méthylation de l'ADN entre eucaryotes et procaryotes
Qu'est-ce que la méthylation de l'ADN ?
Pendant plus de décennies, on pensait que les bases modifiées par méthylation existaient à une faible fréquence dans l'ADN. Les méthyltransférases (ADN méthylases) transmettent le groupe méthyle chimiquement actif de la S-adénosylméthionine soit au carbone 5 des solvants de cytosine, soit au groupe amino exocyclique qui est fixé au carbone 6 des résidus d'adénine.m6A) de la chaîne d'ADN sont impliqués dans cette altération de l'ADN.
Figure 1. Voies de méthylation de l'ADN. (Moore et al., 2013)
Le Séquence de méthylation de l'ADN est particulier aux espèces. Une petite proportion des résidus de cytosine sont méthylés dans l'ADN de certains procaryotes, tandis que seuls les résidus d'adénine sont méthylés chez certains autres. L'ADN contient à la fois de la 5-méthylcytosine (m5Cyt) et de la N6-méthyladénine (m6Ade) dans le troisième groupe d'organismes procaryotes. Dans l'ensemble, l'ADN eucaryote est méthylé uniquement par des résidus de cytosine.
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Méthylation de l'ADN chez les procaryotes
Méthylation de l'ADN est utilisé dans les bactéries comme un signal pour la régulation d'une interaction particulière entre l'ADN et les protéines. En général, les processus de méthylation consistent en une ADN méthylase et une ou plusieurs protéines se liant à l'ADN, ce qui peut coïncider avec le site de méthylation cible sur l'ADN, obstruant ainsi la méthylation de ce site.
La méthylation du site cible restreint la liaison des protéines, ce qui peut conduire à deux états de méthylation alternatifs, méthylés et non méthylés, du site cible. Cela tend à conduire à une séquence de Méthylation de l'ADN qui régit quels gènes sont exprimés, et donc comment l'écosystème interagit avec un microorganisme.
Dans les génomes de bactéries, d'archées et de phages, il existe des niveaux limités de C5-méthylcytosine, de N4-méthylcytosine et de N6-méthyladénine. La méthylation de l'ADN se produit après la réplication et est facilitée par des ADN méthyltransférases qui ciblent des séquences spécifiques. Les ADN méthyltransférases prokaryotes se classent en deux catégories : celles intégrées dans des systèmes de restriction-modification et des enzymes autonomes dépourvues d'un homologue d'enzyme de restriction. Les fonctions principales de Méthylation de l'ADN impliquer la modulation des interactions entre les protéines liant l'ADN et leurs sites cibles respectifs. Ces fonctions incluent la protection contre la restriction de l'ADN, la facilitation de la discrimination des brins lors de la réparation des mésappariements, la régulation du cycle cellulaire et le contrôle de la transcription. Méthylation de l'ADN impacte également les interactions des pathogènes bactériens avec leurs hôtes, suggérant des applications potentielles pour des thérapies épigénétiques dans la lutte contre les maladies infectieuses.
Figure 2. Vue d'ensemble schématique de l'évolution des motifs de méthylation de l'ADN procaryote, avec quatre mécanismes évolutifs. (Anton et al., 2021)
Méthylation de l'ADN chez les eucaryotes
Méthylation de l'ADN chez les eucaryotes, il est fréquemment utilisé pour désactiver la fonction de signalisation des gènes. Dans de nombreux mécanismes eucaryotes, tels que la croissance embryonnaire, l'empreinte génomique, l'inactivation du chromosome X, et généralement le maintien de la cohérence des chromosomes, Méthylation de l'ADN a été affiché comme ayant une fonction vitale. Chez les mammifères, où la phase de méthylation pour 75 % de tous les dinucléotides CpG se trouve dans les cellules somatiques, le processus est très précis.
Considérant l'ampleur de l'influence de Méthylation de l'ADNIl n'est donc pas étrange que plusieurs maladies, comme celles observées chez les humains, soient également liées à ces effets. La tendance globale de la méthylation chez les mammifères rend difficile l'évaluation de savoir si la méthylation est une situation par défaut ou si elle est dirigée vers des séquences géniques particulières. Les îlots CpG, cependant, se trouvent généralement près des sites de démarrage de la transcription, ce qui implique qu'il existe un cadre d'identification.
Figure 3. Relation évolutive des ADN méthyltransférases eucaryotes. (Schmitz et al., 2019)
Différence entre la méthylation de l'ADN chez les procaryotes et les eucaryotes
Méthylation de l'ADN se produit chez les eucaryotes uniquement sur les résidus de cytosine et surtout pour les séquences CpG. Alors que chez les procaryotes, le principal signal épigénétique est la méthylation des résidus d'adénine. Seules quelques ADN méthyltransférases sont utilisées par les eucaryotes ; chez les bactéries, où beaucoup d'entre elles ont une grande précision de séquence, les chiffres sont beaucoup plus élevés. Le pathogène gastrique humain significatif Helicobacter pylori, par exemple, possède un large répertoire de gènes d'ADN méthyltransférase, avec différentes souches impliquant des séquences distinctes et plutôt particulières.
Même ainsi, chez les procaryotes et les eucaryotes, le mécanisme de défense de Méthylation de l'ADN est comparable. Chez les humains et les rongeurs, par exemple, des séquences virales intégrées peuvent être méthylées pour supprimer les gènes concernés. Chez les souris également, les mêmes processus ont été découverts pour supprimer les transgènes. Les caractéristiques de reconnaissance et d'éradication de Méthylation de l'ADN les machines, par conséquent, semblent être préservées.
Comme le génome eucaryote est beaucoup plus complexe par rapport au génome procaryote, l'impact de la cytosine méthylée en tant que "cinquième base" dans le génome eucaryote a été suggéré par de nombreuses recherches. De plus, de nombreuses études ont montré que la méthylation de la cytosine est impliquée dans la réorganisation fonctionnelle du génome eucaryote.
Tableau 1 Différence entre la méthylation de l'ADN chez les procaryotes et les eucaryotes
| Aspecte | Prokaryotes | Eucaryotes |
| Type de méthylation | Habituellement, la N6-méthyladénine (N6-mA) | Habituellement, la C5-méthylcytosine (C5-mC) |
| Fonction | Associé aux systèmes de restriction-modification, défense contre l'ADN étranger. | Impliqué dans la régulation de l'expression génique, la stabilité du génome, la différenciation cellulaire. |
| Type de méthyltransférase | Souvent partie des systèmes de restriction-modification, spécifique aux séquences d'ADN double brin. | Plus complexe, peut être spécifique aux séquences mais avoir aussi un contexte plus large de méthylation. |
| Héritage | Typiquement héritée verticalement, transmise aux cellules progénitrices par le biais de la division cellulaire. | Hérité par la division cellulaire et, dans certains cas, peut être transmis à la descendance par les gamètes. |
Méthodes de séquençage de la méthylation de l'ADN
Une analyse du méthylome de l'ADN a été réalisée en utilisant microarrays Depuis de nombreuses années. Le séquençage de la méthylation de l'ADN est une innovation récemment développée, principalement basée sur la conversion au bisulfite pour distinguer les cytosines méthylées des cytosines non méthylées. Les cytosines non méthylées sont transformées en uraciles lors du diagnostic au bisulfite, tandis que les 5mCs restent non réactifs et sont conservés. Les cytosines non méthylées sont lues comme de la thymine lors de la phase de séquençage, tandis que les cytosines méthylées sont toujours lues comme des cytosines.
Figure 4. L'évolution de la méthodologie de profilage de la méthylation de l'ADN. (Li et al., 2021)
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Le séquençage basé sur la conversion par bisulfite peut être réalisé soit comme Séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS) ou Séquençage bisulfite à représentation réduite, basé sur la couverture génomique (RRBS). WGBS des frais plus élevés et une implication beaucoup plus grande dans l'évaluation des données affiliées. Au lieu de cela, le RRBS offre une méthode rentable pour étudier la méthylation de l'ADN en échantillonnant des zones du génome riches en CpG. L'ADN génomique est traité avec une enzyme de restriction insensible à la méthylation, comme MspI, pour effectuer RRBSPour créer une bibliothèque pour le séquençage, les fragments d'ADN digérés sont ensuite soumis à la ligation d'adaptateurs, à la conversion par bisulfite et à la PCR.
Figure 5. Aperçu de WGBS et RRBS. (Li et al., 2021)
WGBS et RRBS sont deux techniques de séquençage reposant sur le traitement au bisulfite. De plus, les méthodologies qui tirent parti de cette approche englobent séquençage de méthylation/hydroxyméthylation de l'ADN ciblé (oxBS-seq). Dans oxBS-seqLa conversion de 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) en 5-formylcytosine (5fC), puis en uracile (U) après traitement au bisulfite, permet l'identification précise de 5-méthylcytosine (5mC). OxBS-seq présente un flux de travail expérimental simplifié par rapport à la BS-seq, permettant la quantification spécifique de 5mC et 5hmC à chaque site de cytosine modifié dans l'échantillon d'ADN.
La deuxième catégorie comprend des méthodes de séquençage basées sur la capture par des anticorps spécifiques, incluant principalement séquençage par immunoprécipitation de l'ADN méthylé (meDIP-seq), séquençage par immunoprécipitation de l'ADN hydroxyméthylé (hmeDIP-seq)et séquençage par immunoprécipitation à 6mA (6mA-IP-seq). meDIP-seq est une technique de détection de la méthylation du génome entier basée sur le principe de l'enrichissement par anticorps. Elle utilise l'immunoprécipitation de l'ADN méthylé pour enrichir sélectivement les fragments d'ADN méthylés sur le génome à l'aide d'anticorps 5mC. Par la suite, le séquençage à haut débit permet des études de haute précision, denses en CpG et sur des régions hautement méthylées au niveau du génome entier. 6mA-IP-seq utilise des anticorps conçus pour la modification de l'ADN 6mA afin d'enrichir sélectivement les régions génomiques portant la modification 6mA. Lorsqu'il est associé à séquençage à haut débitCette approche permet une cartographie précise des modifications de 6mA sur le génome. 6mA-IP-seq présente des avantages significatifs, notamment une grande précision, une large plage de détection, une spécificité de ciblage exceptionnelle et une applicabilité polyvalente.
Figure 6. Principe clé de MeDIP-seq. (Li et al., 2021)
De plus, les études de profilage de la méthylation de l'ADN à partir de cellules uniques et d'échantillons minimes sont considérablement limitées par les technologies de séquençage de construction de bibliothèques. Les méthodes traditionnelles de construction de bibliothèques ou les techniques d'amplification de cellules uniques ressemblant à l'ADN génomique sont difficiles à appliquer dans les expériences de méthylation. Le séquençage bisulfite de tout le génome à cellule unique (scWGBS) répond à cette limitation. Le scWGBS est une approche hautement innovante qui combine la préparation de bibliothèques WGBS à cellule unique avec Illumina. séquençage de nouvelle génération technologie. Cette méthode permet de visualiser l'état de méthylation du génome à une résolution unicellulaire, révélant l'hétérogénéité cellulaire généralement masquée par le séquençage de méthylation en vrac standard. Les études de méthylation des cellules uniques et des échantillons rares sont principalement appliquées dans les mécanismes tumoraux, la recherche sur le cancer, le diagnostic préimplantatoire, le développement embryonnaire précoce, la recombinaison des cellules germinales, les cellules souches et les domaines de recherche sur l'hétérogénéité cellulaire.
Références :
- Moore, L., Le, T. & Fan, G. Méthylation de l'ADN et ses fonctions de base. Neuropsychopharmacologie2013, 38, 23–38.
- Li S, Tollefsbol T O. Méthodes de méthylation de l'ADN : analyses globales de la méthylation de l'ADN et méthylomiques. Méthodes, 2021, 187 : 28-43.
- Casadesús J, Sánchez-Romero M A. Méthylation de l'ADN chez les procaryotes[M]//Méthyltransférases de l'ADN - Rôle et Fonction. Cham : Springer International Publishing, 2022 : 21-43.
- Anton B P, Roberts R J. Au-delà de la restriction-modification : rôles épigénomiques de la méthylation de l'ADN chez les procaryotes. Revue annuelle de microbiologie, 2021, 75 : 129-149.
- Schmitz R J, Lewis Z A, Goll M G. Méthylation de l'ADN : caractéristiques partagées et divergentes chez les eucaryotes. Tendances en Génétique, 2019, 35(11) : 818-827.
