Séquençage d'ARN ciblé : Dévoiler les principes de détection, le flux de travail et les diverses applications

RNA-sequne technologie d'analyse de séquençage du transcriptome rendue possible par séquençage à haut débit, initialement axé sur l'étude des niveaux d'expression et des différences de l'ARNm, de l'ARN petit et de l'ARN non codant. Au cours de la dernière décennie, il a connu un développement remarquable et est désormais largement utilisé dans des scénarios tels que l'analyse des variations de transcription, la détection des fusions géniques et l'identification du splicing alternatif. Séquençage d'ARN ciblé, en revanche, se concentre sur l'analyse de transcriptions spécifiques. Semblable au RNA-seq standard, il utilise des méthodes d'enrichissement ciblé pour l'évaluation de l'expression génique, l'analyse des espèces d'ARN, la détection des fusions géniques et des mutations. Cependant, il surpasse le RNA-seq standard en termes de sensibilité, de plage dynamique, de rentabilité et de débit.

Qu'est-ce que le séquençage d'ARN ciblé ?

Le séquençage RNA ciblé représente une technique de séquençage à haut débit. Son objectif est d'analyser des transcrits d'ARN spécifiques pour détecter des phénomènes tels que les fusions géniques, les mutations, les variations d'épissage et les expressions spécifiques au phénotype. En amplifiant sélectivement l'ADNc de la région cible, il réduit les coûts et le temps de séquençage par rapport au séquençage RNA de tout le transcriptome, tout en améliorant la sensibilité et la spécificité des expériences. Les caractéristiques clés du séquençage RNA ciblé sont les suivantes :

Sélectivité de la région cibleLa séquençage d'ARN ciblé amplifie sélectivement la région d'ARN cible grâce à des sondes de capture (comme des sondes d'oligonucléotides marquées à la biotine) ou des amorces spécifiques. Cette approche permet une analyse approfondie de gènes spécifiques, de transcrits ou de familles de gènes.

Sensibilité et spécificitéEn raison de son focus sur des régions spécifiques, le RNA-seq ciblé présente une sensibilité accrue pour détecter des gènes à faible abondance, des gènes de fusion rares ou des variations d'épissage spécifiques. Par exemple, dans la leucémie myéloïde aiguë (LMA), il peut révéler des fusions géniques qui échappent aux méthodes de détection traditionnelles.

Détection de fusion géniqueCette technique est largement utilisée dans la recherche sur le cancer, en particulier dans les maladies hématologiques, pour détecter les événements de fusion génique. Par exemple, elle peut identifier la fusion du gène CRLF2 dans la leucémie aiguë lymphoblastique B de type Ph.

Détection des mutations et des variations d'épissageLe séquençage d'ARN ciblé est capable de détecter des mutations ponctuelles, des insertions ou des délétions, ainsi que des variations d'épissage complexes.

Analyse d'expression spécifique au phénotypeEn analysant les motifs d'expression de l'ARN dans des types cellulaires ou des tissus spécifiques, le séquençage d'ARN ciblé contribue à révéler les mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies.

Il est important de noter que bien que le séquençage d'ARN ciblé soit un outil puissant pour une analyse d'ARN hautement sensible et spécifique dans des domaines de recherche spécifiques, son application doit être adaptée aux besoins de recherche particuliers. Le combiner avec d'autres technologies, telles que le séquençage d'ARN de transcriptome complet, peut donner des résultats plus complets.

Séquençage d'ARN ciblé par capture de cibles (Hrdlickova et al., 2016)

Le principe du séquençage d'ARN ciblé

Le séquençage d'ARN ciblé est une méthode d'analyse du transcriptome basée sur la technologie de séquençage à haut débit, qui vise à couvrir en profondeur et à analyser avec précision la région génique ou l'ARN d'intérêt grâce à des conceptions et des stratégies expérimentales spécifiques. Son principe de base est le suivant.

Sélection de la région cible et conception de la sondeTout d'abord, il est nécessaire d'identifier la région cible de l'ARN à séquencer. Ces régions sont généralement des transcrits de gènes, de l'ARN non codant, etc., liés à des problèmes biologiques ou des maladies spécifiques. Selon la séquence de nucléotides de la région cible, une sonde spécifique complémentaire est conçue. Les sondes sont généralement des molécules d'ADN ou d'ARN simple brin, et leur longueur varie généralement de dizaines à des centaines de paires de bases. Elles peuvent se lier spécifiquement à la séquence d'ARN cible. Afin de faciliter l'opération ultérieure, la sonde peut être marquée avec des étiquettes spéciales telles que la biotine.

Extraction et fragmentation de l'ARNL'ARN total est extrait d'échantillons biologiques (tels que des cellules et des tissus) pour garantir que l'ARN extrait a une haute intégrité et pureté. Ensuite, des méthodes physiques (comme le traitement ultrasonique) ou des méthodes enzymatiques (comme la ribonucléase) sont utilisées pour couper l'ARN en fragments de taille appropriée, généralement d'environ 100 à 500 bases de longueur, afin de faciliter les réactions d'hybridation et de séquençage ultérieures.

Capture par hybridationHybridisez l'ARN fragmenté avec la sonde conçue. À une température et une concentration en sel appropriées, la sonde se liera spécifiquement au fragment d'ARN cible ayant une séquence complémentaire pour former un hybride ARN-sonde. Les fragments d'ARN non ciblés restent dans un état libre sans se lier à la sonde. Afin d'améliorer l'efficacité et la spécificité de l'hybridation, certains réactifs pour favoriser l'hybridation, tels que le formamide, sont généralement ajoutés au système d'hybridation.

EnrichissementLes hybrides sonde-ARN sont séparés du système mixte en utilisant des étiquettes spéciales marquées sur les sondes et des techniques de capture correspondantes. Par exemple, si la sonde est marquée avec de la biotine, des billes magnétiques de streptavidine peuvent être utilisées pour la capture. La streptavidine a une forte affinité avec la biotine, ce qui permet de lier spécifiquement l'hybride sonde-ARN marqué avec de la biotine, puis les billes magnétiques et leurs fragments d'ARN cibles liés sont séparés par force magnétique pour enrichir l'ARN cible et éliminer un grand nombre d'ARN non cibles.

Construction de bibliothèque et séquençageLa construction de la bibliothèque a été réalisée sur les fragments d'ARN cibles capturés et enrichis. En général, cela inclut l'ajout de séquences de connecteurs spécifiques aux deux extrémités des fragments d'ARN pour les faire combiner avec les amorces de la plateforme de séquençage. Ensuite, la bibliothèque a été amplifiée par PCR pour augmenter la quantité d'ARN cible pour le séquençage ultérieur. Enfin, la bibliothèque construite est chargée sur la plateforme de séquençage à haut débit pour le séquençage, et les informations de séquence de l'ARN sont déterminées en détectant le signal de chaque base, afin d'obtenir les données de séquence détaillées de la région d'ARN cible pour une analyse bioinformatique ultérieure, comme l'analyse de l'expression génique et la détection de mutations.

Séquençage d'ARN ciblé par séquençage d'amplicons (Hrdlickova et al., 2016)

Comment fonctionne le séquençage d'ARN ciblé ?

Le séquençage d'ARN ciblé comprend généralement la préparation des échantillons, la construction de la bibliothèque, le séquençage et l'analyse des données. Voici une introduction détaillée.

Préparation de l'échantillon

• Collecte d'échantillons : Sélectionnez des échantillons biologiques appropriés, tels que le sang, les tissus et les cellules, en fonction de l'objectif de la recherche. Assurez-vous que le processus de collecte des échantillons respecte les spécifications afin de maintenir l'intégrité et l'activité biologique de l'ARN.
• Extraction d'ARN : L'ARN total est extrait de l'échantillon par des méthodes appropriées telles que la méthode TRIzol et la méthode des billes magnétiques. Après extraction, l'intégrité de l'ARN est détectée par électrophorèse sur gel d'agarose ou par bioanalyseur, et la concentration et la pureté de l'ARN sont déterminées par spectrophotomètre pour s'assurer qu'elles répondent aux exigences des expériences ultérieures.
• Fragmentation de l'ARN : Des méthodes physiques telles que le traitement ultrasonique ou des méthodes enzymatiques telles que la RNase sont utilisées pour couper l'ARN en fragments de taille appropriée, et la longueur des fragments est généralement d'environ 100-500 pb.

Construction de bibliothèque

• Hybridation de sonde : Concevoir et synthétiser une sonde spécifique pour la région d'ARN cible, puis l'hybrider avec l'ARN fragmenté dans des conditions spécifiques, afin que la sonde puisse se lier spécifiquement à la séquence complémentaire de l'ARN cible.
• Capture et enrichissement : Le fragment d'ARN cible lié à la sonde est capturé en utilisant de la biotine et d'autres marqueurs étiquetés sur la sonde, et l'ARN non lié ainsi que les impuretés sont éliminés par lavage et d'autres opérations pour réaliser l'enrichissement de l'ARN cible.
• Transcription inverse : La transcriptase inverse et les amorces sont ajoutées à l'ARN cible enrichi, et l'ADNc est synthétisé avec l'ARN comme modèle.
• Ajouter des liaisons : Ajouter des séquences de liaison spécifiques à chaque extrémité de l'ADNc pour fournir des sites de liaison pour l'amplification PCR ultérieure et le séquençage.

Amplification par PCR : Le cDNA avec le linker est amplifié par réaction PCR pour augmenter le nombre de séquences cibles pour l'analyse de séquençage ultérieure.

Séquençage

• Séquençage en ligne : La bibliothèque construite est chargée sur une plateforme de séquençage à haut débit, telle qu'Illumina et PacBio, et séquencée selon leurs principes et processus de séquençage respectifs pour générer un grand nombre de données de séquençage brutes.

Analyse de données

• Prétraitement des données : contrôle de la qualité des données de séquençage originales, suppression des séquences de faible qualité, des séquences de liaison, etc. pour améliorer l'exactitude et la fiabilité des données.
• Comparaison et annotation : Comparez les données traitées avec le génome ou le transcriptome de référence, déterminez la position de chaque séquence dans le génome et effectuez une annotation génétique pour identifier les informations spécifiques sur le gène et le transcript de l'ARN cible.
• Analyse différentielle : Selon l'objectif de la recherche, l'expression différentielle des gènes entre différents échantillons a été analysée afin d'identifier les gènes exprimés de manière différentielle, et d'explorer davantage les gènes clés et les voies liés aux maladies ou aux processus biologiques.

Aperçu du flux de travail de préparation de bibliothèque d'amplicons compétitifs et de l'analyse des données (Blomquist et al., 2013)

Les avantages et les inconvénients du séquençage d'ARN ciblé

En tant que technologie de séquençage importante, le séquençage d'ARN ciblé est largement utilisé en biologie et en recherche médicale. Voici ses avantages et inconvénients.

Avantages

• Haute sensibilité et spécificitéLe séquençage d'ARN ciblé peut fournir une profondeur de séquençage et une sensibilité supérieures en capturant spécifiquement les molécules d'ARN cibles, en particulier pour la détection de transcrits à faible abondance. Par exemple, dans le diagnostic des malignités hématologiques, le séquençage d'ARN ciblé peut identifier des marqueurs cliniquement pertinents (tels que LSC177 ou pLSC632) et détecter des mutations somatiques acquises.
• Efficacité coût-efficacitéLe séquençage d'ARN ciblé réduit le coût de séquençage en diminuant la quantité d'ARN non ciblé séquencé. Par exemple, la méthode de préparation de bibliothèque d'amplification PCR multiplex concurrentielle peut maintenir la cohérence entre différentes dates, la préparation de bibliothèque et les laboratoires, tout en réduisant considérablement les coûts.
• Réduire les interférences de fondLe séquençage d'ARN ciblé évite le problème de la liaison non spécifique des sondes ou de l'hybridation croisée des sondes, réduisant ainsi l'interférence de fond. De plus, en optimisant la conception, les signaux faussement positifs peuvent être réduits.
• Flexibilité et adaptabilitéLa plateforme de séquençage d'ARN ciblé est hautement adaptable et peut être intégrée dans les pipelines de dépistage de Qualcomm et le développement de composés pour étudier l'expression des protéines de stress dans des voies de signalisation spécifiques.
• Adapté aux échantillons complexesLe séquençage d'ARN ciblé fonctionne bien dans des échantillons complexes (tels que le sang et les tissus tumoraux) et peut détecter des transcrits de fusion, des mutations génétiques et des sauts d'exons.

Inconvénients

• Manque de complexité dans le designLe séquençage d'ARN ciblé nécessite des amorces et des sondes soigneusement conçues pour garantir la capture spécifique de l'ARN cible. Cela peut nécessiter des connaissances et une expérience professionnelles.
• Couverture limitéeLe séquençage d'ARN ciblé ne séquence généralement que des molécules d'ARN spécifiques ou des régions géniques, il ne peut donc pas couvrir entièrement l'ensemble du groupe de transcription. Cela peut entraîner l'omission de gènes ou de transcrits qui ne sont pas capturés par la cible.
• Limitation techniqueLe séquençage RNA ciblé peut être affecté par la déviation de l'amplification PCR, en particulier dans la préparation de bibliothèques d'amplification PCR multiplex, où différents cibles peuvent être biaisées en raison de la différence d'efficacité d'amplification. De plus, certaines techniques (comme la réduction du bruit des codes-barres moléculaires) sont rarement utilisées dans le séquençage ciblé car elles peuvent introduire des interférences non spécifiques.
• Interprétation complexe des donnéesL'interprétation des données de séquençage d'ARN ciblé doit être combinée avec des connaissances biologiques pour distinguer les signaux réels du bruit technique potentiel. Par exemple, lors de la détection de l'ARN néonatal, cela peut être affecté par la dégradation de l'ARN pendant l'immunoprécipitation.
• Champ d'application limitéLe séquençage d'ARN ciblé est plus adapté à l'étude de problèmes biologiques spécifiques ou de mécanismes de maladie qu'à une analyse génomique complète. Par exemple, dans l'analyse microbienne, la méthode de séquençage de génome entier peut être plus appropriée pour l'estimation de l'abondance des espèces.

Le séquençage d'ARN ciblé est une technologie efficace, économique et sensible, qui est adaptée à la recherche de molécules d'ARN spécifiques et au diagnostic des maladies. Cependant, sa complexité de conception, sa couverture limitée et ses limitations techniques constituent les principaux défis à surmonter.

Représentation schématique de la manière dont la préparation de bibliothèques d'amplicons compétitifs réduit le suréchantillonnage (Blomquist et al., 2013)

Applications du séquençage RNA ciblé

Le séquençage d'ARN ciblé est une technologie d'analyse du transcriptome à haute précision, qui peut détecter et quantifier efficacement les gènes d'intérêt en enrichissant ou en amplifiant l'ARN dans des régions génomiques spécifiques. Cette technologie a été largement utilisée dans de nombreux domaines, y compris la recherche sur le cancer, le développement de médicaments, la neurogénomique et le diagnostic clinique.

Recherche sur le cancer

Le séquençage d'ARN ciblé a des applications importantes dans la recherche sur le cancer, en particulier dans la détection des fusions géniques des tumeurs, l'analyse des mutations géniques et des profils d'expression.

• Détection de la fusion génique des tumeurs : Le séquençage d'ARN ciblé peut identifier des partenaires de fusion génique connus et inconnus, en particulier dans des échantillons de tissus fixés (comme les FFPE). Cette méthode peut détecter des gènes de fusion rares causés par des translocations récessives ou des microdélétions, offrant ainsi de nouvelles cibles pour le traitement du cancer.
• Analyse de l'hétérogénéité du cancer : La technologie de séquençage d'ARN ciblé peut révéler l'hétérogénéité au sein de la tumeur et aider à comprendre la complexité et la réponse au traitement de la tumeur.
• Détection précoce du cancer : Le séquençage d'ARN ciblé améliore la sensibilité et la précision de la détection précoce du cancer en enrichissant les ARN non codants de longue chaîne (lncRNA).

Extraction d'ARN et préparation de l'échantillon dans le cancer (Hong et al., 2020)

Développement de médicaments

Le séquençage d'ARN ciblé joue un rôle important dans le développement de médicaments. Il peut déterminer avec précision des régions spécifiques de l'ARN, aider à identifier des cibles médicamenteuses, évaluer l'efficacité des médicaments en analysant les changements d'ARN avant et après l'action du médicament, et également trouver les caractéristiques de l'ARN lié à la résistance aux médicaments, ce qui fournit une base clé pour optimiser les médicaments et prédire les risques de résistance médicamenteuse, et accélère le processus de recherche et développement de médicaments sûrs et efficaces.

• Régulation de l'expression génique : Grâce au séquençage d'ARN ciblé, les chercheurs peuvent analyser les changements d'expression génique des cellules après un traitement médicamenteux et identifier des cibles potentielles pour les médicaments.
• Construction de modèles de maladies : En utilisant la technologie de séquençage RNA de Qualcomm, nous pouvons établir un modèle d'hétérogénéité tumorale à partir de patients pour prédire la réponse aux médicaments.

Neurogénomique

Le séquençage d'ARN ciblé est largement utilisé dans la recherche sur le neurogénome. Il peut se concentrer avec précision sur la transcription des gènes liés aux nerfs, révéler les différences d'expression génique et les anomalies d'épissage alternatif dans le développement nerveux et les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer en analysant des séquences d'ARN spécifiques, et aider à analyser le mécanisme des maladies nerveuses et à explorer des cibles thérapeutiques potentielles.

• Recherche sur le développement neural : En analysant le transcriptome des cellules nerveuses, nous pouvons révéler le schéma d'expression génique dans le processus de développement neural.
• Étude sur le mécanisme des maladies neurologiques : Le séquençage d'ARN ciblé peut aider à identifier l'expression génique anormale liée aux maladies neurologiques et fournir des indices pour le diagnostic et le traitement de ces maladies.

Aperçu de l'approche utilisée pour analyser l'ARN afin d'aider au diagnostic de la dysferlinopathie (Rufibach et al., 2023)

Diagnostic clinique

Le séquençage d'ARN ciblé est largement utilisé dans le diagnostic clinique, car il peut détecter avec précision les transcrits de gènes liés aux tumeurs et aider au dépistage précoce, au typage et au jugement du pronostic du cancer. Il peut identifier l'ARN pathogène et aider au diagnostic rapide des maladies infectieuses ; il peut également être utilisé pour détecter les variations d'ARN liées aux maladies génétiques et fournir une base clé pour le diagnostic clinique, l'élaboration de plans de traitement et le suivi des maladies.

• Détection des gènes de fusion : Grâce au séquençage RNA ciblé, les gènes de fusion dans les maladies hématologiques, tels que LSC17 ou P63LSC2, peuvent être détectés, fournissant ainsi un soutien au diagnostic clinique.
• Diagnostic des maladies rares : Le séquençage d'ARN ciblé peut être utilisé pour identifier les gènes pathogènes des maladies rares et aider au diagnostic et au traitement en analysant les profils d'expression de gènes spécifiques.

Étude de cas sur le séquençage d'ARN ciblé dans les fusions géniques

Les gènes de fusion peuvent conduire à des séquences anormales ou à des protéines fonctionnelles, ou à un déséquilibre de l'expression de certains gènes, et ensuite entraîner ou promouvoir l'apparition de tumeurs. Il est rapporté que l'incidence du cancer humain causé par des gènes de fusion est d'environ 20 %. Cependant, la prévalence des gènes de fusion varie considérablement selon les différents cancers, et de nombreux gènes de fusion sont spécifiques à des sous-types de cancer particuliers. Par conséquent, l'identification rapide et précise des gènes de fusion peut diagnostiquer le cancer de manière qualitative et hiérarchique.

L'ARN a été extrait des lignées cellulaires K562 et RDES, et comparé à l'ARN-seq conventionnel par ARN-seq ciblé. Les résultats ont montré que l'abondance des ERCC dans le séquençage ARN-seq ciblé était 59 fois (panneau sanguin) et 33 fois (panneau de tumeur solide) supérieure à celle du séquençage ARN-seq conventionnel, et l'entrée minimale du séquençage par capture ciblée était de 3pM. Cela montre que les deux panneaux dans le séquençage ARN ciblé ont une forte capacité de capture.

Les chercheurs ont évalué la fiabilité du gène de fusion détecté par deux panels. Les résultats ont montré que l'uniformité de la couverture des transcrits du panel dans les tumeurs hématologiques et les tumeurs solides était bonne, et la couverture des sites d'épissage connus était respectivement de 77,8 % et 84,6 %. Cela montre que les deux panels dans le séquençage par capture ciblée d'ARN ont la capacité de détecter la plupart des gènes de fusion.

L'étude a également comparé la détection de gènes de fusion à faible copie entre le séquençage d'ARN ciblé et le séquençage d'ARN conventionnel. Les résultats ont montré qu'il n'y avait pas de différence significative entre les deux méthodes pour détecter BCR-ABL1 (8-24 copies d'ADN) dans la lignée cellulaire K562. Cependant, lorsque EWSR1-FLI1 (une seule copie d'ADN) a été détecté dans la lignée cellulaire RDES, le séquençage d'ARN conventionnel n'était pas couvert par des lectures au début du site de fusion. Cela montre que le séquençage par capture ciblée d'ARN présente des avantages évidents par rapport au séquençage d'ARN conventionnel pour la détection de gènes de fusion à faible abondance.

Aperçu du séquençage d'ARN ciblé et de la validation des panels (Heyer et al., 2019)

Conclusion

Le séquençage d'ARN ciblé, en tant que moyen puissant d'étudier avec précision des ARN spécifiques, repose sur un principe unique. Tout d'abord, il conçoit des sondes complémentaires en fonction de la région d'ARN cible, qui peuvent se lier spécifiquement à l'ARN cible comme une "navigation précise". L'ARN de l'échantillon est extrait, fragmenté et hybridé avec la sonde, puis l'hybride ARN cible-sonde est capturé et enrichi par le marqueur. Ensuite, la bibliothèque est construite et séquencée pour réaliser le séquençage approfondi de la région d'ARN cible. Ses avantages sont évidents. Comparé au séquençage de transcriptome complet, il peut se concentrer davantage sur des régions clés, avec un coût inférieur et une profondeur de séquençage plus élevée, ce qui est pratique pour la détection précise d'ARN à faible abondance. Cependant, il présente également des limites, ne s'appliquant qu'aux zones cibles connues, et peut manquer de nouveaux transcrits ou variations.

Dans le domaine de l'application, le séquençage d'ARN ciblé est largement utilisé. Dans la recherche scientifique, il aide à explorer les fonctions des gènes et révèle leur rôle dans les processus biologiques en détectant avec précision l'expression de gènes spécifiques. Dans le domaine médical, il peut être utilisé pour le diagnostic et l'évaluation du pronostic des maladies, comme le séquençage ciblé des gènes liés aux tumeurs, aidant ainsi au diagnostic précoce et à la surveillance des maladies tumorales. Il peut également être utilisé dans la recherche et le développement de médicaments. En surveillant les changements de l'ARN cible sous l'action des médicaments, l'efficacité et la toxicité potentielle peuvent être évaluées, fournissant un soutien de données clé pour le développement de nouveaux médicaments.

Références:

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