Séquençage de l'ADN

Qu'est-ce que l'ADN ?

L'ADN, enchevêtré dans une structure en double hélice ressemblant à une échelle en spirale, sert de matériel génétique fondamental dans tous les organismes vivants. Composé de quatre lettres chimiques—adénine (A), thymine (T), guanine (G) et cytosine (C)—ce script moléculaire tisse ensemble 6 milliards de lettres (3 milliards de bases), encapsulant l'intégralité des informations de la vie.

L'acide désoxyribonucléique (ADN) est un acide nucléique crucial, portant les instructions génétiques essentielles à la synthèse de l'ARN et des protéines au sein des cellules vivantes. Il apparaît comme une biomolécule indispensable au développement et au bon fonctionnement des organismes. La séquence des bases dans les nucléotides de l'ADN constitue la base de l'information génétique. Cette information subit une transcription pour créer de l'ARN, et par la suite, l'ARNm qu'il contient subit une traduction pour générer des polypeptides, constituant ainsi des protéines.

La réplication de l'ADN, un processus précédant la division cellulaire, assure la préservation de l'information génétique, évitant sa perte à travers les générations. Chez les eucaryotes, l'ADN réside dans des structures appelées chromosomes au sein du noyau. Dans les organismes dépourvus de noyau, l'ADN se trouve dans des chromosomes ou d'autres tissus (les bactéries possèdent des molécules d'ADN double brin en boucle unique, tandis que les virus abritent des génomes d'ADN ou d'ARN). Les protéines de la chromatine comme les histones et les cohésines jouent un rôle essentiel dans le maintien de la structure ordonnée de l'ADN au sein des chromosomes. Ces structures orchestrent l'interaction entre le code génétique et les protéines responsables de la transcription, exerçant un contrôle sur la transcription des gènes.

Pourquoi s'engager dans le séquençage de l'ADN ?

• Le séquençage de l'ADN a pour but de déchiffrer les complexités de la vie, d'explorer les distinctions entre les organismes et d'approfondir les histoires évolutives et développementales des diverses formes de vie.
• Cette technique scientifique joue un rôle essentiel dans l'orientation de l'examen de l'ADN recombinant.
• De plus, le séquençage de l'ADN revêt une importance pratique significative dans le diagnostic des maladies et le génotypage.

Qu'est-ce que le séquençage de l'ADN ?

La technologie de séquençage de l'ADN se situe à la pointe de la génomique et figure parmi les technologies les plus largement utilisées et essentielles dans les sciences de la vie contemporaines.

En 1953, Watson et Crick ont non seulement dévoilé la structure en double hélice de l'ADN, mais ont surtout souligné l'importance du séquençage pour déchiffrer la séquence des bases dans les molécules d'ADN.

L'évolution de la technologie des séquenceurs a traversé quatre étapes distinctes et réalisé quatre percées, passant de la "lecture pré-directe" à la "lecture directe", des processus manuels à l'automatisation, des méthodes basées sur des plaques à l'électrophorèse en gel capillaire (marquant la réalisation initiale du séquençage à grande échelle), et enfin, avançant vers le séquençage massivement parallèle.

4 Jalons dans la technologie de séquençage de l'ADN

Première percée : Lecture directe

• Pré-lecture directe : La méthode de séquençage originale précédant la lecture directe impliquait des techniques telles que le clonage moléculaire, la PAGE et l'autoradiographie radiographique.
• Méthode SBC : Une réaction de dégradation chimique utilisant des réactifs spécifiques pour dégrader directement les molécules d'ADN. Gilbert a reçu le prix Nobel de chimie en 1980 pour avoir inventé la méthode SBC.
• Méthode SBS : Basée sur la réaction de synthèse enzymatique et la synthèse d'ADN, également connue sous le nom de Méthode de Sanger ou méthode de terminaison terminale de l'acide désoxyribonucléique double. Cette méthode présente des avantages tels que des réactifs non toxiques, une facilité d'opération, des résultats stables, une grande précision et une excellente reproductibilité.

Deuxième percée : Automatisation

• Pionniers du séquençage automatisé : Akiyoshi Wada, Wilhelm Ansorge.
• La percée clé dans l'automatisation de la méthode SBS est survenue avec l'invention par Leroy Hood du séquenceur SBS automatisé à quatre couleurs fluorescentes. Cette innovation a joué un rôle crucial dans le soutien et le lancement du Projet Génome Humain (PGH).

Troisième percée : montée en puissance

• L'émergence et l'amélioration de la technologie de séquençage par électrophorèse capillaire ont facilité l'augmentation de l'échelle.
• En 1998, ABI a introduit le séquenceur capillaire ABIPrism 3700 (ABI3700), permettant une montée en puissance directe de la technologie de séquençage. L'introduction ultérieure de la série de séquenceurs MegaBACE a grandement contribué à l'achèvement précoce du HGP.

Quatrième percée : Séquençage massivement parallèle

Cela représente un bond en avant substantiel, caractérisé par la capacité de séquencer l'ADN de manière massivement parallèle, ce qui permet une analyse rapide et simultanée de plusieurs fragments. L'une des caractéristiques clés du séquençage est sa contribution significative à la chute vertigineuse des coûts de séquençage.

Types de technologies de séquençage de l'ADN

• Séquençage de Sanger

L'ère initiale de la technologie de séquençage de l'ADN reposait soit sur la méthode de terminaison de brin, introduite par Sanger et Coulson en 1975, soit sur la méthode chimique impliquant la dégradation des brins, pionnière par Maxam et Gilbert en 1976-1977. Ces techniques sont couramment regroupées sous le nom de méthode de Sanger pour des raisons de simplicité. Un moment décisif est survenu en 1977 lorsque Sanger a réussi à déterminer la première séquence génomique—spécifiquement celle du phage phiX-174, composée de seulement 5 375 bases.

Veuillez lire notre article :

Séquençage Sanger : Introduction, Flux de travail et Applications.

Questions et réponses sur le séquençage Sanger

• Séquençage de nouvelle génération (NGS)

Avec l'évolution et l'amélioration continues des projets de génome, le séquençage de première génération a rencontré des limitations en termes de débit, de vitesse et de coût, le rendant inadapté à séquençage à grande échelle des exigences telles que le séquençage profond et le séquençage des répétitions. Pour relever ces défis, l'émergence du séquençage de nouvelle génération a marqué une étape transformative. Au cours de plus d'une décennie d'évolution technologique et de dynamiques de marché, des technologies pionnières telles que Roche454 et ABI Solid, qui brillaient autrefois, ont progressivement disparu.

Veuillez lire notre article : Qu'est-ce que le séquençage de nouvelle génération (NGS) ?

Actuellement, le paysage est dominé par les fabricants d'équipements NGS grand public, notamment les séries Nextseq et MiniSeq d'Illumina (reconnues comme la plateforme NGS grand public mondiale) et les séquenceurs MGISEQ et DNBSEQ de UWM. Il est à noter que la plateforme NGS de UWM continue de maintenir une position concurrentielle.

L'avancement et l'adoption généralisée de ces technologies ont considérablement accéléré les efforts de recherche dans rééchantillonnage du génome, séquençage génomique à grande échelle, Séquençage de la méthylation de l'ADN, séquençage du transcriptome, séquençage de régions génomiques cibléesdétection des modifications épigénétiques des gènes, identification microbienne, et plus encore. Notamment, ces innovations ont efficacement répondu aux défis posés par le coût élevé et le faible débit associés aux technologies de séquençage de première génération. Leur large application s'étend au diagnostic des pathogènes, à la médecine de précision, aux tests cliniques et à la pathologie moléculaire, marquant un impact transformateur sur divers domaines.

• Séquençage à lecture longue

Ces dernières années, des chercheurs ont été à l'avant-garde du développement de la troisième génération de technologies de séquençage—séquençage en temps réel de molécules uniquesCette approche innovante vise à extraire des informations de séquence d'ADN avec une plus grande précision et efficacité. Contrairement à ses prédécesseurs, cette technologie élimine le besoin d'amplification par PCR et repose sur la détection de signaux électriques ou chimiques provenant de molécules d'ADN individuelles, permettant le séquençage de chaque molécule d'ADN de manière indépendante.

Les candidats en tête actuellement dans plateformes de séquençage à lecture longue sont Oxford Nanopore et PacBio.

• Technologie de séquençage par nanopore

Oxford Nanopore Technologies a introduit séquençage d'ADN par nanopore à molécule uniquecentré sur le séquençage des signaux électriques. Le principe implique le passage d'une seule base ou d'une molécule d'ADN à travers un canal nanopore, provoquant des changements discernables dans les propriétés électriques du canal. Les propriétés chimiques distinctes des bases A, T, C et G entraînent des variations des paramètres électriques lors de leur passage à travers le nanopore. La détection de ces changements permet de déterminer le type de base correspondant, révélant finalement la séquence de la chaîne d'ADN. Notamment, technologie des nanopores excelle dans la détection directe d'un plus grand nombre de bases, y compris les sites de méthylation et différents acides aminés.

• Technologie de séquençage en temps réel à molécule unique (SMRT) de PacBio

Technologie de séquençage PacBio RS, une technologie de base largement utilisée dans le séquençage à long lecture, repose sur le marquage fluorescent pendant la synthèse. Le principe consiste à capturer le modèle d'ADN avec une polymérase, où quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) distincts marqués fluorescentement entrent aléatoirement dans la zone de détection et se combinent avec la polymérase par mouvement brownien. Les bases correspondant au modèle d'ADN forment des liaisons chimiques, ce qui entraîne une durée d'interaction plus longue par rapport aux bases non correspondantes. Cette interaction prolongée facilite l'excitation des dNTP marqués fluorescentement et permet la détection des signaux fluorescents correspondants. En identifiant les groupes fluorescents émis à différentes longueurs d'onde, l'espèce des bases étendues peut être déterminée, culminant dans le séquençage du modèle d'ADN après traitement de l'information.