Services de séquençage de ctDNA

Introduction du séquençage de l'ADN circulant (ctDNA)

l'ADN tumoral circulant (ctDNA) est un type d'ADN extracellulaire présent dans les fluides corporels tels que le plasma, le sérum, le liquide céphalorachidien, etc. Il provient principalement de cellules tumorales nécrotiques ou apoptotiques, de vésicules extracellulaires sécrétées par des cellules tumorales et de cellules tumorales circulantes. La taille typique du ctDNA se situe dans une fourchette de 160 à 180 paires de bases. Le ctDNA est un sous-ensemble de l'ADN libre de cellules (cfDNA) et constitue une proportion relativement faible (entre 0,1 % et 1 %), ce qui rend sa détection difficile. La maturation de séquençage de nouvelle génération (NGS) La technologie a considérablement amélioré la sensibilité et la précision de la détection de l'ADN tumoral circulant (ctDNA).

L'ADN circulant libre (cfDNA) se compose principalement d'ADN de lignage provenant de cellules normales, tandis que l'ADN tumoral circulant (ctDNA) chez les patients atteints de cancer est relativement rare et très variable. Par conséquent, les méthodes d'analyse de l'ADN conventionnelles telles que Séquençage de Sanger et le séquençage par pyrophosphate manquent de la sensibilité requise pour détecter les mutations somatiques dans l'ADN tumoral circulant (ctDNA) des patients atteints de cancer. Actuellement, il existe trois principales méthodes d'analyse pour le ctDNA : les techniques de PCR quantitative représentées par ARMS, les techniques de PCR digitale représentées par ddPCR, et les techniques de détection à haut débit basées sur Séquençage de nouvelle génération (NGS)Ces dernières années, la spectrométrie de masse des acides nucléiques et les technologies EFIRM ont également émergé.

Pour améliorer le débit de détection et l'efficacité, les technologies de séquençage centrées sur NGS sont largement utilisés pour l'analyse en aval de l'ADNct, allant de génome entier ou séquençage de l'exome entier à un séquençage ciblé d'un génome limité. NGS permet un séquençage profond parallèle à haut débit de plusieurs segments d'acides nucléiques de gènes, facilitant la détection simultanée de plusieurs gènes, de diverses formes (telles que des mutations, des changements de nombre de copies et des fusions de gènes) et de mutations inconnues. L'implication de plusieurs gènes dans l'évaluation du pronostic et de l'efficacité du traitement pourrait avoir un impact significatif sur les résultats pronostiques.

Caractéristiques du séquençage de l'ADN tumoral circulant

Échantillonnage de convenanceUne analyse ctDNA non invasive, en temps réel et facilement accessible plusieurs fois est réalisée par l'extraction de sang, éliminant ainsi les risques et l'inconfort associés aux méthodes invasives telles que les biopsies et les chirurgies pour collecter des tissus tumoraux. À un stade précoce des tumeurs malignes, des altérations du contenu en ctDNA et des gènes peuvent être détectées.

Technologie de détection mature: Haute sensibilité, haute précision, faible taux de faux positifs Utilisation NGS La détection de ctDNA garantit une haute sensibilité et précision, détectant des mutations aussi faibles que 0,1 %. Comparé à d'autres types de marqueurs tumoraux, le ctDNA présente une sensibilité supérieure, ce qui en fait un biomarqueur tumoral idéal.

Détection complète: Large gamme d'application Presque toutes les cellules tumorales libèrent des fragments d'ADN dans la circulation sanguine. Par conséquent, l'ADN tumoral circulant (ctDNA) reflète l'état global des tumeurs dans le corps. L'hétérogénéité impacte significativement les tests génétiques dans les tissus tumoraux, mais la détection du ctDNA atténue le caractère aléatoire et local associé à l'hétérogénéité des tissus tumoraux. Cela garantit des résultats plus complets et fiables pour les mutations tumorales.

Avantages du séquençage de l'ADN circulant (ctDNA)

• Service complet : Nous proposons un service tout compris, couvrant l'ensemble du processus, de l'extraction de ctDNA, à la préparation de la bibliothèque, au séquençage, jusqu'à l'analyse des données.
• Entrée ctDNA ultra-basse : Notre technologie permet le séquençage avec des quantités de ctDNA de départ aussi faibles que 10 ng.
• Contrôle Qualité Rigoureux : Un processus de contrôle qualité rigoureux est mis en œuvre à chaque étape, garantissant une grande précision dans les résultats fournis à nos clients.
• Analyse bioinformatique spécialisée : Notre équipe de bioinformatique compétente est prête à répondre aux besoins d'analyse de données personnalisées de nos clients.

Application du séquençage de l'ADN circulant (ctDNA)

• Détection du cancer à un stade précoce : En examinant l'ADN tumoral circulant (ctDNA) dans le sang, il devient possible d'identifier des mutations spécifiques aux tumeurs dans les premiers stades, améliorant ainsi les perspectives d'un diagnostic précoce.
• Surveillance du cancer : La surveillance dynamique des niveaux de ctDNA chez les patients offre des informations sur les variations de la charge tumorale, fournissant un moyen d'évaluer l'efficacité du traitement et la progression de la maladie.
• Prédiction de la récidive : La résurgence ou l'élévation des niveaux de ctDNA lors des suivis postopératoires ou post-traitement peut potentiellement prédire la récidive du cancer.
• Thérapie personnalisée : Grâce à l'analyse des résultats de séquençage de l'ADN tumoral circulant (ctDNA), les cliniciens peuvent concevoir des régimes de traitement sur mesure, choisissant des thérapies ciblées ou modifiant les stratégies de traitement en conséquence.

Notre service de séquençage ctDNA fourni

Reséquençage de l'ADN entier pour ctADN

Nous proposons un séquençage complet du génome pour l'ADN circulant tumoral (ctDNA), permettant l'analyse de divers types de mutations portées par le ctDNA, telles que les polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs), les insertions et les délétions (indels), ainsi que les grandes variations structurelles.

Séquençage de l'exome pour ctADN

Semblable à l'ADN génomique conventionnel, une quantité suffisante de ctDNA peut subir un séquençage de l'exome pour détecter des variations dans les régions codantes.

Séquençage de méthylation pour ctADN

Le séquençage de méthylation pour l'ADNct est un point focal dans la recherche. Cela inclut la détection des sites de méthylation pour des gènes individuels et la détection complète des sites de méthylation à travers tout le génome.

Séquençage de région ciblée pour ctADN

Notre panneau de région ciblée pour ctDNA permet la détection et l'analyse de sites cibles spécifiques. En comparaison avec séquençage du génome entier, cette méthode offre une solution plus rentable.

Figure 1. Vue d'ensemble schématique des principales étapes du traitement des échantillons de sang et de l'extraction de l'ADNcf. (Bohers et al., 2021)

Flux de travail de séquençage de l'ADNct

CD Genomics propose des services de séquençage ctDNA rapides et précis ainsi qu'une analyse bioinformatique.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Types d'échantillons : Plasma, sérum ou cfDNA provenant de patients atteints de cancer. Le plasma est recommandé plutôt que le sérum pour minimiser l'interférence de l'ADNc dérivé des lymphocytes. Volume d'échantillon : Plasma > 5 mL ; Sérum > 10 mL ; cfDNA > 10 ng. Extraction de plasma : 1. Collectez du sang total dans des tubes anticoagulants EDTA, en évitant la congélation ; conservez brièvement à 2-8℃ avant de procéder rapidement à une centrifugation à basse température pour obtenir du plasma. 2. Si la centrifugation à basse température n'est pas possible, utilisez des tubes non invasifs STRECK avec un stabilisateur propriétaire pour la préservation du sang total, permettant une centrifugation à température ambiante. 3. Pour éliminer les cellules résiduelles, le plasma doit subir une centrifugation secondaire : d'abord à 4℃ à 1600g pendant 10 minutes, suivie d'une seconde centrifugation à 4℃ à 16000g pendant 10 minutes. Stockage des échantillons : Congeler rapidement les échantillons de plasma et de sérum dans de l'azote liquide et les conserver à -80℃. Éviter les cycles répétés de congélation-dégel pendant le stockage des échantillons. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Plateforme Illumina HiSeq 2000
	Analyse bioinformatique Contrôle de la qualité des données brutes Nettoyage des données Alignement de génome de référence Appel de variantes Annotation de variante Filtrage des variantes Analyse des variants spécifiques aux tumeurs Évaluation de la charge tumorale …et plus encore Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage de l'ADN circulant (ctDNA) pour votre rédaction (personnalisation)

Références

1. Michail Ignatiadis, et al. La biopsie liquide entre dans la clinique - problèmes de mise en œuvre et défis futurs. Nat Rev Clin Oncol. 2021 M
2. Ming Chen, Séquençage de nouvelle génération dans la biopsie liquide : dépistage du cancer et détection précoce. Hum Génomique2019 1 août ; 13(1) : 34.
3. Carolin M Sauer, Suivi longitudinal de la charge de la maladie et de la réponse à l'aide de ctDNA à partir de gouttes de sang séché dans des modèles de xénogreffe. EMBO Mol Med. 2022
4. Etienne Giroux Leprieur, Séquençage de l'exome entier de ctDNA séquentiel dans l'adénocarcinome pulmonaire avancé avec une réponse tumorale initiale durable sous inhibiteur de point de contrôle immunitaire et une progression tardive. J Immunother Cancer. 2020
5. Anjui Wu, Caractéristiques de la méthylation de l'ADN plasmatique à l'échelle du génome dans le cancer de la prostate métastatique. J Clin Invest. 2020
6. Jianxia Chen, et al. Conception d'un test de séquençage ciblé pour détecter des mutations rares dans l'ADN tumoral circulant. Test génétique des biomarqueurs moléculaires. 2019
7. Bohers E, Viailly P J, Jardin F. Séquençage de cfDNA : approches technologiques et problèmes bioinformatiques. Produits pharmaceutiques, 2021, 14(6) : 596.

Résultats de la démo

Références

1. Chen, KZ., Lou, F., Yang, F. et al. Détection de l'ADN tumoral circulant chez des patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules à un stade précoce par séquençage ciblé. Sci Rep, 2016, 6, 31985.
2. Deveson I W, Gong B, Lai K, et al. Évaluation de la validité analytique des tests de séquençage de l'ADN tumoral circulant pour l'oncologie de précision. Biotechnologie de la nature, 2021, 39(9) : 1115-1128.

FAQ sur le séquençage de l'ADN tumoral circulant (ctDNA)

1. Quels sont les avantages et les inconvénients de l'ADNc circulant par rapport aux tests histologiques ?

• Avantages : En comparaison avec les tests histologiques, l'analyse de ctDNA offre des méthodes non invasives ou peu invasives, facilite les prélèvements répétés, et présente des délais de collecte, de traitement et de rapport plus courts. Elle peut surmonter l'hétérogénéité spatiale des tumeurs et fournir des informations en temps réel, relativement complètes sur les caractéristiques moléculaires de la tumeur d'un patient. De plus, le ctDNA plasmatique peut également augmenter le taux de détection des mutations des gènes conducteurs.
• Inconvénients : Contrairement aux échantillons de tissus, le ctDNA dans le sang périphérique a une teneur plus faible, ce qui peut entraîner des résultats faussement négatifs lors des tests cliniques. La présence de variations germinales ou de mutations de l'hématopoïèse clonale peut également provoquer des faux positifs si les globules blancs ne sont pas utilisés comme contrôle. De plus, il existe des variations dans les quantités de ctDNA libérées dans la circulation sanguine par différents patients atteints de cancer ou par le même patient à différents moments, ce qui pose des défis pour les tests cliniques et l'interprétation des résultats.

2. Pourquoi le test ctDNA nécessite-t-il une sensibilité plus élevée ?

Le nombre de cellules tumorales dans le corps d'un patient atteint de cancer est significativement inférieur à celui des cellules normales, et les niveaux d'ADNc libre dans le plasma sont généralement faibles. L'ADNc tumoral ne représente que 0,1 % à 5 % de l'ADNc libre, avec des différences substantielles dans les niveaux d'ADNc tumoral dans le plasma entre les différents types de cancer et les stades de la maladie. Par conséquent, par rapport aux tests tissulaires, la détection de l'ADNc tumoral nécessite une sensibilité et une spécificité plus élevées.

Les technologies actuelles utilisées pour la biopsie liquide de l'ADN tumoral circulant (ctDNA) incluent principalement l'ARMS-PCR, la PCR numérique (ddPCR) et séquençage de nouvelle génération (NGS).

3. Qu'est-ce que le séquençage non ciblé dans l'analyse de l'ADN circulant (ctDNA) ?

Le séquençage non ciblé dans l'analyse de l'ADN circulant (ctDNA) fait référence à l'approche consistant à examiner le ctDNA sans se concentrer à l'avance sur des altérations spécifiques, une méthodologie qui englobe Séquençage de l'exome entier (WES) et Séquençage du génome entier (WGS). Le séquençage génomique complet (WGS), en particulier, a été utilisé pour l'analyse de l'ADN tumoral circulant (ctDNA) en raison de sa capacité à révéler des variations spécifiques aux tumeurs sans connaissance préalable des mutations potentielles. Cela permet d'identifier des altérations génétiques associées à la résistance au traitement et de cibler de nouveaux objectifs exploitables. Néanmoins, le WGS présente des inconvénients tels que des taux de sensibilité plus faibles de 5 à 10 %, des coûts élevés, des délais de détection prolongés et une complexité accrue dans l'analyse des données, rendant son intégration dans la pratique clinique une tâche redoutable.

4. Comment le séquençage ciblé est-il réalisé dans l'analyse de l'ADN circulant?

Séquençage ciblé peut enrichir des fragments cibles par PCR ou capture hybride. Les conceptions de séquençage ciblé basées sur la PCR utilisent des dizaines à des centaines de primers PCR ciblant des gènes spécifiques pour l'enrichissement. Les conceptions de séquençage ciblé basées sur la capture hybride utilisent des sondes ciblant des gènes spécifiques et les enrichissent par capture hybride.

5. Quelles stratégies sont utilisées pour améliorer la sensibilité et la spécificité dans l'analyse de l'ADN tumoral circulant (ctDNA) ?

En raison de la complexité de séquençage de nouvelle génération (NGS) Les flux de travail, les erreurs introduites lors de la construction de la bibliothèque, l'enrichissement des fragments cibles et le séquençage entraînent inévitablement du bruit de fond. Ce bruit de fond peut obscurcir les mutations à faible fréquence dans les échantillons de ctDNA, conduisant à des résultats faussement négatifs ou faussement positifs, limitant ainsi la sensibilité et la spécificité de la détection du ctDNA. Par conséquent, la plupart des technologies de séquençage ciblé basées sur le NGS visent à réduire le bruit de fond et à améliorer la sensibilité et la spécificité, utilisant souvent des stratégies de marquage moléculaire. Au départ, des codes-barres en ADN simple brin étaient utilisés, mais maintenant, la plupart des stratégies utilisent des codes-barres en ADN double brin. Bien que les codes-barres double brin offrent une meilleure suppression des erreurs, ils ont une efficacité relativement inférieure, les rendant moins optimaux pour les échantillons de cfDNA limités dans les contextes cliniques.

Études de cas sur le séquençage de l'ADN circulant tumoral (ctDNA)

Analyse de séquençage de l'ADN tumoral circulant dans l'adénocarcinome gastro-œsophagien

Journal : Recherche clinique sur le cancer
Facteur d'impact : 10,86
Publié : 1 décembre 2019

Contexte

L'adénocarcinome gastro-œsophagien (AGE) est un problème de santé mondial majeur avec des taux de survie limités malgré des traitements optimaux. Bien que basé sur des tissus séquençage de nouvelle génération (NGS) a identifié des altérations génomiques clés (AG), l'hétérogénéité intrapatiente compliquant la thérapie ciblée. Des études récentes suggèrent que le ctDNA-NGS, offrant une méthode non invasive, pourrait mieux orienter la sélection de la thérapie ciblée en fournissant une vue d'ensemble des AG et en surmontant certaines limitations du tissu-NGS. Cette étude analyse une grande cohorte de patients atteints de GEA en utilisant le ctDNA-NGS pour évaluer ses limites de détection, sa corrélation avec les résultats cliniques et son potentiel à prédire la réponse à la thérapie et la résistance.

Méthodes

Résultats

Les tests de cfDNA plasmatique reposent sur la libération de l'ADN tumoral (ctDNA) dans la circulation sanguine, se mélangeant avec l'ADN cf normal. La fréquence allélique maximale des variants somatiques tumoraux (maxVAF) reflète le plus grand clone de ctDNA et aide à estimer la quantité globale de ctDNA et la sous-clonalité. Chez les patients de stade IV non traités, un maxVAF plus élevé est corrélé à une plus grande charge tumorale et à des sites métastatiques spécifiques, indiquant que la localisation et l'étendue de la maladie affectent de manière significative la libération de ctDNA et la sensibilité de détection.

Fig 1. La détection de l'ADN tumoral circulant (ctDNA) et le nombre d'altérations détectées sont dictés par des sites de maladie spécifiques et la charge de la maladie.

La ctDNA-NGS clinique est utilisée pour identifier des altérations génomiques exploitables (GAs) et peut potentiellement servir de biomarqueur pronostique pour les maladies à un stade précoce et avancé. Chez les patients localement avancés, la ctDNA détectable était associée à une survie sans maladie plus courte, et les niveaux de ctDNA post-chirurgie prédisaient la récidive. Chez les patients au stade IV avancé, des niveaux de ctDNA plus élevés (maxVAF) étaient corrélés à un pronostic moins favorable. L'analyse sérielle de la ctDNA-NGS a indiqué qu'un déclin significatif du maxVAF pendant la thérapie de première ligne prédisait une meilleure survie. Parmi les patients traités par des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire, un maxVAF plus bas était lié à une survie globale plus longue.

Fig 2. Implications pronostiques de maxVAF et des changements sériels dans les contextes périopératoire et de métastases nouvellement diagnostiquées.

Au moment du diagnostic initial, l'hétérogénéité spatiale de HER2 et d'autres altérations génomiques (Gas) chez les patients atteints de GEA est significative. Dans une étude portant sur 34 patients atteints de GEA au stade IV non traités, le ctDNA-NGS et le tissu-NGS provenant de sites primaires et métastatiques ont montré que seulement 26 % des Gas étaient universellement concordants entre les échantillons, soulignant la valeur complémentaire des deux méthodes. Le ctDNA-NGS a également détecté une hétérogénéité temporelle et des mutations de résistance acquise après thérapie, ce qui peut guider les traitements ultérieurs optimaux. Cela souligne l'importance de combiner le ctDNA-NGS avec le tissu-NGS pour une évaluation complète de l'hétérogénéité tumorale et des mécanismes de résistance.

Fig 3. Hétérogénéité spatiale et temporelle intrapatient par NGS tissulaire multisite et NGS ctDNA.

La ctDNA-NGS peut identifier des altérations génomiques pronostiques et prédictives (GAs) chez les patients atteints de GEA. Les mutations dans PIK3CA et BRAF sont associées à une mauvaise survie, tandis que les amplifications HER2 et EGFR, lorsqu'elles sont identifiées à la fois par ctDNA-NGS et tissu-NGS, prédisent de meilleurs résultats avec les thérapies ciblées. La combinaison de ctDNA-NGS avec tissu-NGS améliore la détection des GAs, offrant une évaluation plus complète pour guider les stratégies de traitement.

Fig 4. Analyse de survie des patients atteints de GEA de stade IV non traités selon des GA spécifiques.

Conclusion

Cette étude, la plus grande de son genre, a utilisé le ctDNA-NGS pour analyser 1 630 patients atteints de GEA. Elle a établi des limites de détection, confirmé la valeur pronostique du ctDNA résiduel après chirurgie et cartographié le paysage des GA, montrant que le ctDNA-NGS identifie avec précision les GA exploitables et les mécanismes de résistance. La combinaison du ctDNA-NGS avec le tissu-NGS améliore la détection, suggérant que le ctDNA-NGS peut améliorer le suivi et le traitement du GEA, bien que des validations supplémentaires soient nécessaires.

Référence

1. Maron S B, Chase L M, Lomnicki S, et al. Analyse de séquençage de l'ADN tumoral circulant dans l'adénocarcinome gastro-œsophagien. Recherche clinique sur le cancer, 2019, 25(23) : 7098-7112.