Introduction aux marqueurs moléculaires de l'ADN

Les marqueurs moléculaires représentent une catégorie spécifique au sein de la classification plus large des marqueurs génétiques. Dans un contexte général, les marqueurs génétiques englobent des traits qui permettent de suivre l'héritage de diverses caractéristiques génétiques présentes sur un chromosome, un segment chromosomique particulier ou un emplacement génique spécifique au sein d'une lignée familiale. Les marqueurs génétiques se caractérisent par deux caractéristiques fondamentales : l'héritabilité et la capacité à être distingués. Essentiellement, toute mutation génétique entraînant des différences discernables dans le phénotype au sein d'un organisme particulier peut remplir le rôle de marqueur génétique. Cela fait des marqueurs génétiques un outil vital dans la recherche et l'analyse génétiques.

Quels sont les marqueurs moléculaires ?

Les marqueurs génétiques, qui proviennent des variations dans les séquences de nucléotides entre les individus, offrent une représentation directe du polymorphisme génétique au niveau de l'ADN. Ils servent de moyen direct pour obtenir des informations sur les distinctions au sein de l'ADN génomique de divers individus biologiques ou populations. Ce concept fondamental souligne leur importance dans la recherche et l'analyse génétiques.

Avantages des marqueurs moléculaires

1. Ils sont présentés sous forme d'ADN et ne sont pas contraints par des facteurs tels que les tissus, le stade de développement, la saison ou l'environnement. Ils ne souffrent pas de problèmes liés à l'expression ou à son absence, montrant une stabilité.
2. Ils sont nombreux, répartis sur l'ensemble du génome.
3. Ils présentent un polymorphisme élevé, avec de nombreuses variations alléliques existant dans la nature.
4. De nombreux marqueurs présentent une nature co-dominante, permettant de différencier les génotypes homozygotes et hétérozygotes, ce qui les rend pratiques pour la sélection de traits agronomiques récessifs.
5. Ils ont un effet neutre, n'influençant pas l'expression des traits cibles et n'ayant aucun lien avec des caractéristiques indésirables.
6. Leurs méthodes de détection sont simples et rapides.

Comparaison des marqueurs co-dominants et dominants

Deux termes importants dans le contexte des marqueurs moléculaires sont les marqueurs dominants et les marqueurs co-dominants. En termes simples, les marqueurs moléculaires qui peuvent distinguer entre les génotypes hétérozygotes sont considérés comme des marqueurs co-dominants.

Applications des technologies de marqueurs moléculaires

Construction de Cartes de liaison génétiqueLes marqueurs moléculaires sont essentiels dans la construction de cartes de liaison génétique, qui fournissent des informations précieuses sur la localisation et l'ordre des gènes sur les chromosomes.

Cartographie des gènes/QTL : Ces marqueurs jouent un rôle crucial dans la localisation des gènes et des Loci de Caractères Quantitatifs (QTL), aidant à l'identification des facteurs génétiques responsables de traits spécifiques.

Sélection Assistée par Marqueurs Moléculaires : Les marqueurs moléculaires aident à la sélection en permettant le transfert ciblé de traits souhaités d'un organisme à un autre, améliorant ainsi l'efficacité des programmes de reproduction.

Analyse de la diversité génétique des plantes : Les marqueurs moléculaires sont utilisés pour évaluer et caractériser la diversité génétique au sein des populations de plantes, contribuant à la conservation et à l'utilisation des ressources génétiques.

Évaluation de la variété et de la qualité de la pureté : Elles sont utilisées pour identifier et déterminer la pureté génétique et l'identité variétale des matériaux végétaux, garantissant l'intégrité des variétés de cultures.

Détection des maladies : Des marqueurs moléculaires sont utilisés dans la détection de marqueurs génétiques associés aux maladies, facilitant le diagnostic et la gestion des maladies tant chez les plantes que chez les animaux.

Types de marqueurs moléculaires

Première génération - RFLP (Polymorphisme de longueur des fragments de restriction)

L'application des marqueurs RFLP de première génération a diminué au fil du temps. RFLP, qui signifie polymorphisme de longueur des fragments de restriction, implique la détection des variations dans les fragments d'ADN résultant de changements tels que des substitutions de bases, des insertions, des délétions ou des duplications qui affectent les sites de reconnaissance des endonucléases de restriction sur le génome végétal.

Le principe de l'RFLP implique la digestion de l'ADN génomique d'individus différents à l'aide d'enzymes de restriction, ce qui produit des fragments d'ADN de tailles variées. Ces fragments sont séparés par électrophorèse et transférés sur une membrane d'hybridation. Un fragment d'ADN spécifique, marqué avec des isotopes ou des non-isotopes, sert de sonde. La sonde s'hybride avec les fragments digérés par l'enzyme, révélant des différences de longueur parmi les fragments ayant des séquences homologues à la sonde.

Procédure de polymorphisme de longueur de fragments de restriction (RFLP) (Sidharth Mishra et al., Avancées en sciences vétérinaires 2019)

Le RFLP (polymorphisme de longueur des fragments de restriction) reflète les différences dans les longueurs des fragments d'ADN générés après digestion avec des endonucléases de restriction, révélant ainsi la distribution des différents sites de reconnaissance des enzymes au niveau moléculaire de l'ADN.

Les avantages des marqueurs RFLP incluent leur nature principalement co-dominante ainsi que leur haute reproductibilité et stabilité.

Cependant, les marqueurs RFLP présentent plusieurs inconvénients, notamment des procédures expérimentales complexes, des périodes de détection prolongées, des coûts élevés et une adéquation limitée pour le breeding moléculaire à grande échelle. De plus, l'utilisation d'isotopes radioactifs dans la détection peut entraîner une contamination. Les méthodes de marquage non radioactif ont tendance à être plus coûteuses, ce qui entraîne des signaux d'hybridation plus faibles et une sensibilité réduite.

Technologies de marqueurs moléculaires basées sur la PCR

Les technologies de marqueurs moléculaires basées sur la PCR de deuxième génération sont actuellement les plus largement utilisées en génétique moléculaire. Les marqueurs polymorphes détectés par PCR, qui comprennent à la fois la PCR directe et la PCR combinée avec des approches de digestion enzymatique, relèvent de la catégorie des marqueurs PCR. Ces marqueurs incluent les RAPD, SSR, STS, CAPS et dCAPS, entre autres.

RAPD, ADN polymorphe amplifié au hasardimplique l'utilisation de courtes amorces aléatoires typiquement couvrant 8 à 10 paires de bases pour amplifier l'ADN génomique par PCR. Lorsque la distance entre les sites de liaison pour deux amorces complémentaires inverses respecte les conditions d'amplification par PCR, un produit d'amplification est généré. Toute insertion, suppression ou mutation survenant entre les sites de liaison des amorces ou aux sites de liaison entraîne la présence ou l'absence de bandes dans le motif électrophorétique des produits PCR, donnant lieu à des marqueurs RAPD.

Illustration schématique de l'analyse de polymorphisme de longueur amplifiée aléatoire. (Satyanarayan Panigrahi et al.) Diversité microbienne à l'ère génomique 2019)

Avantages des marqueurs RAPD :
Une méthode simple avec détection rapide.
Une quantité minimale d'ADN est nécessaire, et il y a des exigences de qualité de l'ADN assez flexibles.
Le même ensemble de primers peut être appliqué pour l'analyse génomique à travers divers organismes, facilitant l'examen des génomes complets.

Limitations des marqueurs RAPD :
Ce sont des marqueurs dominants et ils ne peuvent pas faire la distinction entre les génotypes homozygotes dominants et hétérozygotes, ce qui entraîne des données incomplètes.
L'utilisation de courts amorces dans les marqueurs RAPD rend le processus de PCR sensible aux variables expérimentales, entraînant la présence de multiples bandes et une diminution de la cohérence des résultats.

marqueurs SSRLes marqueurs de répétition de séquence simple, également connus sous le nom d'ADN microsatellite ou de répétitions en tandem courtes (STR), représentent une classe de séquences d'ADN composées d'une unité répétitive de plusieurs (1-6) nucléotides. Les motifs de répétition courants incluent (TG)n, (GA)n, (AAT)n ou (GACA)n, avec (AT)n étant le plus répandu dans les génomes végétaux. Ces séquences centrales sont largement distribuées dans les génomes eucaryotes et certains génomes procaryotes, trouvées de manière aléatoire dans l'ADN nucléaire, l'ADN chloroplastique et l'ADN mitochondrial. Les SSR ont généralement des longueurs de 100 paires de bases ou moins.

Le principe des SSR repose sur la haute conservation des séquences en copie unique de part et d'autre de l'ADN microsatellite. Ainsi, des amorces peuvent être conçues sur la base de ces séquences flanquantes pour l'amplification par PCR, et la taille des produits PCR peut être déterminée par électrophorèse. Le haut polymorphisme des marqueurs SSR résulte principalement des variations dans le nombre de répétitions en tandem au sein de la séquence centrale.

Principe du marqueur SSR. (Ksenija Taski-Ajdukovic) Panneau de recherche 2015)

Avantages des marqueurs SSR :
Représenter des marqueurs co-dominants, permettant de différencier les hétérozygotes des homozygotes.
Nécessitent de petites quantités d'échantillons d'ADN et ne sont pas trop exigeants en termes de qualité de l'ADN.
Faire preuve d'une bonne répétabilité et d'une haute fiabilité.
Afficher un degré élevé de diversité allélique, entraînant un polymorphisme significatif.

Limitations des marqueurs SSR :
La connaissance de la séquence d'ADN aux deux extrémités du motif de répétition est essentielle. Dans les cas où cette information n'est pas accessible dans les bases de données ADN, le séquençage et la conception de primers deviennent nécessaires, entraînant des coûts de développement accrus.

Marqueurs AFLP, ou l'amplification des fragments de longueur polymorphe, fait référence à des marqueurs polymorphes créés par l'amplification de fragments d'ADN digérés par des enzymes de restriction. Les différences apparaissent en raison de mutations de nucléotides uniques, d'insertion, de suppressions et d'autres mutations qui entraînent des changements dans les sites de reconnaissance des enzymes de restriction. Ces différences peuvent être détectées par une amplification PCR sélective. L'AFLP est une évolution du RFLP, la distinction résidant dans la méthode de détection. L'AFLP révèle des polymorphismes aux sites des enzymes de restriction et des variations de bases sélectives subséquentes.

Le principe de l'AFLP repose à la fois sur la digestion par des enzymes de restriction et sur la technologie PCR. L'ADN génomique est d'abord digéré avec deux enzymes de restriction, ce qui donne des fragments d'ADN de tailles variées. Des adaptateurs artificiels sont ensuite ligaturés aux extrémités de ces fragments de restriction, servant de modèles pour la réaction d'amplification. Une pré-amplification est réalisée en utilisant le brin complémentaire de l'adaptateur artificiel comme amorce. Par la suite, 1 à 3 bases sélectives sont ajoutées aux produits pré-amplifiés comme amorces pour l'amplification sélective. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide est utilisée pour la séparation, et les polymorphismes sont détectés en fonction des différences de longueurs de fragments amplifiés.

Polymorphisme de longueur de fragments amplifiés (G. Dorado, Module de Référence en Sciences Biomédicales, 2017)

Avantages des marqueurs AFLP :
Combine la fiabilité de la technologie RFLP et l'efficacité de la technologie PCR, permettant la détection d'un grand nombre de fragments digérés par des enzymes de restriction en une seule réaction. Elle fournit des informations sur 50 à 100 bandes spectrales en une seule course.
Offre des marqueurs dominants (présence ou absence de bandes) et co-dominants (différences de longueur dues à des insertions ou des suppressions).
Ne nécessite pas le coût de développement de marqueurs étiquetés mais nécessite l'optimisation de primers spécifiques et de combinaisons de primers.
Ne nécessite pas d'informations sur la séquence d'ADN génomique.
Nécessite seulement une quantité minimale d'ADN.

Inconvénients des marqueurs AFLP :
Exigences élevées en matière de qualité des échantillons d'ADN.
Utilise souvent la coloration argentique, qui peut être relativement chronophage et coûteuse.
Les marqueurs AFLP ne sont pas uniformément répartis sur les chromosomes et ont tendance à se regrouper dans des régions proches des centromères.

Marqueurs SNP

SNP, qui signifie polymorphisme d'un seul nucléotideest un marqueur de troisième génération qui concerne la diversité des nucléotides au niveau génomique. Il découle de variations d'un seul nucléotide, telles que des transitions, des transversions, des insertions, des suppressions, entre autres, au sein d'une séquence d'ADN.

Les SNPs peuvent être détectés et analysés en utilisant diverses techniques. Lorsqu'une séquence d'ADN connue est disponible, elle peut être comparée à des bases de données de séquences d'ADN, y compris des génomes de référence ou des génomes d'espèces étroitement apparentées, pour identifier les SNP existants. De plus, si les SNP se trouvent à certains sites de reconnaissance d'enzymes de restriction, des amorces peuvent être conçues en fonction des séquences flanquant le SNP pour l'amplification par PCR. Les produits de PCR peuvent être digérés avec des enzymes de restriction et soumis à une électrophorèse pour les transformer en marqueurs CAPS co-dominants. Alternativement, des amorces peuvent être conçues pour placer le SNP à l'extrémité 3', et la présence ou l'absence de bandes amplifiées est utilisée pour les convertir en marqueurs PCR dominants. Des méthodes plus directes incluent le séquençage de l'ADN ou l'utilisation de techniques d'hybridation sur puce à ADN pour la détection.

Un flux de travail schématique décrivant le développement et l'évaluation des marqueurs SNP.

Marqueurs SNP :

Avantages :
Abondants en nombre et largement répartis dans les génomes.
Haute stabilité.
Nature co-dominante.
Adapté au dépistage rapide et à grande échelle.

Inconvénients :
Coût élevé lors de l'utilisation de méthodes de séquençage ou d'hybridation par puce ADN.

Comparaison de Divers Marqueurs Moléculaires d'ADN